[发明专利]高产对氨基苯丙氨酸的重组大肠杆菌构建方法

说明书

本发明涉公开了一种高产对氨基苯丙氨酸的重组大肠杆菌构建方法。本发明筛选了来自不同菌株中的PAPA生物合成途径，并通过组合优化确定了高产PAPA的途径来源。将该组合途径转入大肠杆菌中，并对宿主菌株进行基因工程改造，强化分支酸合成途径的同时削弱其代谢途径。得到最终可以高产PAPA的重组大肠杆菌。该菌株的PAPA产量可达752.63mg/L。本发明为PAPA的工业化生产和应用奠定了基础。

技术领域

本发明属于合成生物学或者代谢工程领域，涉及对氨基苯丙氨酸(p-aminophenylalanine，PAPA)高产菌株的构建方法，具体涉及一种高产对氨基苯丙氨酸的重组大肠杆菌构建方法。

背景技术

对氨基苯丙氨酸(p-amino phenylalanine，PAPA)作为一种非蛋白源性氨基酸，是一种较为稀有的天然产物结构砌块。在自然界中，PAPA存在于多种不同的微生物中。例如，在珍贵束丝放线菌A.pretiosum中，PAPA是其次级代谢产物dnacin B1的骨架来源，该化合物具有优良的抗肿瘤活性；在委内瑞拉链霉菌S.venezuelae中，PAPA是其次级代谢产物氯霉素chloramphenicol的结构单元，而氯霉素是一种应用非常广泛的抗菌药物；在始旋链霉菌S.pristinaespiralis中，PAPA是其次级代谢产物普那霉素pristinamycin A的结构单元，该化合物也是一种常用的抗菌素；在荧光假单胞菌P.fluorescens中，PAPA可以形成次级代谢产物吡嗪类化合物DMBAP和MeDMBAP。此外，PAPA还是抗癌药物美法仑的合成砌块，该药物对多发性骨髓瘤有明显疗效。因此大量获得PAPA具有一定的工业价值和药用价值。

在微生物中，PAPA的生物合成起始于分支酸。首先，分支酸在4-氨基脱氧分支酸合成酶PapA的作用下形成4-氨基脱氧分支酸，再经过4-氨基脱氧分支酸变位酶PapB的催化形成4-氨基脱氧预苯酸，再经过4-氨基脱氧预苯酸脱水酶PapC的作用形成对氨基苯丙酮酸。最后再经过一个非特异性的转氨酶作用形成PAPA。而前期的实验表明，大肠杆菌中的酪氨酸转氨酶TyrB可以将对氨基苯丙酮酸转化为PAPA。因此利用大肠杆菌作为宿主构建高产PAPA的重组菌株是可行的。为后续大规模工业化生产提供了研究基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产对氨基苯丙氨酸的重组大肠杆菌构建方法。得到一株高产对氨基苯丙氨酸的大肠杆菌工程菌，并通过基因工程改造进一步提高菌株的产量，为其工业化生产奠定了基础。

本发明筛选了来自不同菌株中的PAPA生物合成途径，并通过组合优化确定了高产PAPA的途径来源。将该组合途径转入大肠杆菌中，并对宿主菌株进行基因工程改造，强化分支酸合成途径的同时削弱其代谢途径；最终得到可以高产PAPA的重组大肠杆菌。

本发明的目的是通过以下技术手段实现的。

第一方面，本发明涉及一种合成对氨基苯丙氨酸(p-amino phenylalanine，PAPA)的大肠杆菌工程菌的构建方法，在大肠杆菌中表达了PAPA合成途径中所需的关键酶；所述关键酶包括4-氨基脱氧分支酸合成酶PapA、4-氨基脱氧分支酸变位酶PapB和4-氨基脱氧预苯酸脱水酶PapC。

作为一个实施方案，所述关键酶选择来自不同宿主的PAPA合成途径，包括珍贵束丝放线菌Actinosynnema pretiosum、委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae、始旋链霉菌Streptomyces pristinaespiralis、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的papA、papB、papC基因以及谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum的papA基因。