[发明专利]一种黑曲霉二糖磷酸化酶及其在黑曲霉二糖制备中的应用

说明书

本发明公开了一种黑曲霉二糖磷酸化酶及其在黑曲霉二糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明提供了提供一种新型黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP及其高效表达方法。由化学法合成编码来源于运动厌氧孢杆菌(Anaerosporobacter mobilis DSM 15930)的黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP的核苷酸序列，以穿梭质粒pBSMμL3为表达载体，以Bacillus subtilisWSH11为表达宿主，实现了黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达。黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP与麦芽糖磷酸化酶LbMP协同反应可催化麦芽糖转化生成黑曲霉二糖，产率达到最高为67.75％，黑曲霉二糖的产量能达到338.75g/L，为目前已报道黑曲霉二糖酶法制备的最高产量。因此此酶适合食品、医药等工业应用的需要，能由于黑曲霉二糖的工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种黑曲霉二糖磷酸化酶及其在黑曲霉二糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

黑曲霉二糖(Nigerose)是一种自然界中稀少存在的α-1,3键合的葡萄糖二糖，天然存在于清酒、酱汁等发酵食品中，有优秀的呈味性，具有低甜度、增鲜、具有醇香、预防龋齿、调节肠道健康等多种功效。研究表明，黑曲霉二糖在小鼠体内发挥免疫增强作用，具有作为益生元的潜力；也已被评估为人类细胞系冷冻保存培养基中的添加剂，同时有希望成为生物相容性纳米载体的持续给药模块。

化学合成和酶法制备是生产黑曲霉低聚糖的主要方法，相对于酶法制备，化学合成法成本高昂、产量少，且反应过程中因有重金属离子的参与难以保证其安全性，难以大量生产。日本采用真菌Acremoniun sp.S4G13分泌的α-葡萄糖苷酶以麦芽糖为底物催化制备黑曲霉低聚糖转化率为37％，其中包含黑曲霉二糖组分为23％，整体底物利用率和生产效率较为低下，且产品为α-1,3、α-1,4键型寡糖的混合物，纯度较低。糖苷磷酸化酶(glycoside phosphorylase)是一种催化糖类物质磷酸解生成葡萄糖-1-磷酸及相应残糖的一类酶，同时可催化其逆磷酸解合成反应。与α-葡萄糖苷酶相比，由糖苷磷酸化酶催化的可逆合成反应所用糖基供体为葡萄糖-1-磷酸，反应平衡更有利于糖苷键的合成，转化率一般较高。而葡萄糖-1-磷酸通常可利用相对廉价的糖类底物通过磷酸化反应获得，底物成本低，使得磷酸化酶在工业方面的研究更加广泛。随着新型黑曲霉二糖磷酸化酶的发现与鉴定，使用黑曲霉二糖磷酸化酶与麦芽糖磷酸化酶协同反应成为催化黑曲霉二糖合成的新方法，反应过程如图1所示。

但是目前此种方法的生产效率仍较低，无法实现工业化的需求。

发明内容

鉴于目前黑曲霉二糖产量和生产效率较低的问题，本发明鉴定得到了一种新型黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP，将此酶与麦芽糖磷酸化酶协同催化麦芽糖，可使得黑曲霉二糖产量得到显著提升。

本发明提供了一种重组菌，表达来源于Anaerosporobacter mobilis DSM 15930的黑曲霉二糖磷酸化酶。

在一种实施方式中，编码所述黑曲霉二糖磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，以枯草芽孢杆菌为出发菌株。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis WSH11，记载于公布号为CN108102997A的专利中。

在一种实施方式中，以pBSMμL3为表达载体，载体序列记载于公布号为CN107058205A的专利中。

本发明提供了一种制备黑曲霉二糖的方法，所述方法是以麦芽糖、或麦芽糖和葡萄糖的混合物为底物，将麦芽糖磷酸化酶和利用权利要求1-4任一项所述重组菌表达的黑曲霉二糖磷酸化酶、或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的黑曲霉二糖磷酸化酶共同转化生产黑曲霉二糖。

在一种实施方式中，麦芽糖磷酸化酶和黑曲霉二糖磷酸化酶的加酶量比例为(1～2.5):(1～2.5)。