[发明专利]PEG化的合成KL4肽、其组合物和方法

说明书

所提供的内容涉及mRNA作为吸入干粉制剂的肺部递送和包含所述mRNA的组合物。还提供了使用和制备所述组合物的方法。

1.领域

本公开内容涉及mRNA作为吸入干粉制剂的肺部递送和包含所述mRNA的组合物。还提供了使用和制备所述组合物的方法。

2.背景

使用核酸来操作基因表达是用于治疗许多疾病的强效治疗策略。一个实例是利用信使RNA(mRNA)在体内产生治疗性蛋白质[1]。在20世纪90年代首次报道了体外转录mRNA技术用于在动物中生产蛋白质的成功用途[2,3]，但是，由于对mRNA不稳定性、先天免疫原性的风险和体内递送低效的担心，这些早期有前景的结果并没有立即转化成临床益处。由于近十年中生物技术创新的进步，现在可以产生与未修饰的mRNA相比具有增强的稳定性和降低的免疫原性以及增加的蛋白质表达的化学修饰的mRNA[4,5]。然而，安全且有效的体内递送仍然是mRNA治疗剂开发中的主要障碍。

由于其非侵入性质、增加的局部药物浓度和减少的全身性副作用，由此改善治疗功效，因此通过吸入来局部给予mRNA用于治疗肺部疾病是值得期望的。特别地，干粉制剂对于肺部递送是非常值得期望的。虽然液体气雾剂可以通过雾化被递送至患者的肺，但是核酸的干粉制剂提供了若干另外的优点，诸如优越的稳定性、更好的无菌性和更长的保质期[9]。然而，mRNA的干粉气雾剂的制剂是非常困难的。粉末必须是高度可分散的，并且展现出用于有效的肺沉积的良好的空气动力学性质。考虑到长单链mRNA分子是脆性的并且容易被热应力和剪切应力降解，在干燥过程期间必须保持mRNA的完整性和生物活性[13,14]。尽管有少量文章报道mRNA的液体气雾剂制剂[8,15,16]，但是迄今为止尚未报道产生用于肺部递送的治疗性蛋白质的mRNA的吸入干粉制剂。由于序列中存在疏水性亮氨酸残基，KL4肽作为递送载体的临床应用受到其溶解性差的阻碍。需要提供稳定且有效的mRNA递送载体。

3.概述

肺部递送信使RNA(mRNA)以产生治疗性蛋白质作为对于多种肺部疾病的疗法或疫苗具有相当大的潜力。mRNA的吸入干粉制剂是特别有吸引力的，因为它具有优异的稳定性并且干粉吸入器易于使用。需要安全且有效的mRNA递送载体和合适的粉体工程方法以生产可呼吸的并且在肺中介导稳健转染的制剂。

本文提供了一种新颖的RNA递送载体。在一个实施方案中，该RNA递送载体是PEG₁₂KL4。在一个实施方案中，合成的阳离子KL4肽连接至12聚体的单分散线性聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，PEG₁₂KL4与mRNA以10:1的比率(重量/重量)形成纳米尺寸的复合物，并介导对人肺上皮细胞的有效转染。在某些实施方案中，本文提供了通过喷雾干燥(SD)和喷雾冷冻干燥(SFD)技术配制成干粉的PEG₁₂KL4/mRNA复合物。在某些实施方案中，SD和SFD粉末均展现出令人满意的用于吸入的气雾剂性质，具有分别为4.5μm和1.5μm的质量中值空气动力学直径(MMAD)。在某些实施方案中，干燥之后，保持PEG₁₂KL4/mRNA复合物的生物活性。在一个实施方案中，使用荧光素酶mRNA，以5μg mRNA的剂量气管内给予PEG₁₂KL4/mRNA复合物的液体或粉末气雾剂导致转染后24h时小鼠的肺深部区域中的荧光素酶表达。转染效率优于其中荧光素酶表达更弱且仅限于气管区域的裸mRNA或脂质体(lipoplexes)(Lipofectamine 2000)。单次气管内给药之后，PEG₁₂KL4/mRNA复合物没有免疫原性或毒性的迹象。

本文提供了一种用于肺部递送的mRNA转染剂。本文还提供了具有良好体内转染效率的可吸入的干粉mRNA制剂的制备。

本文提供用于mRNA递送的KL4肽系统。在一个实施方案中，亲水性聚乙二醇(PEG)共价连接至KL4肽。