[发明专利]肠道微生物在诊断肌张力障碍症中的应用

权利要求书

1.检测肠道微生物表达水平的试剂在制备诊断肌张力障碍的试剂盒中的应用，其中所述肠道微生物包括：霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测肠道微生物表达水平的方法为16SrRNA基因组靶向扩增测序和宏基因组测序相结合的方法。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的16S rRNA基因组靶向扩增测序分析

(1)收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，

(2)采用 Qiangen的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒进行微生物核酸提取，

(3)采用针对细菌16S rRNA基因V4区的特异性引物进行扩增，PCR片段回收纯化，

(4)利用Illumina公司的Hiseq 2500进行高通量测序，

(5)测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余，最终行到高质量的可用于后续生物信息学分析的序列数据，

(6)生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量，

(7)利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，

2)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的宏基因组测序分析

(1)收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，

(2)采用试剂盒对微生物组DNA进行片段化处理后，直接进行鸟枪法随机片段测序文库构建，

(3)测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余，

(4)测序数据分别得用现有的生物信息软件进行处理、分析，最终确定微生物组的结构组成，

(5)利用BLASTP对序列数据与KEGG数据库进行比对，对肠道微生物组的基因功能进行注释，

(6)生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量，

(7)利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，

3)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的代谢组学分析

(1)血清样本都在冰上解冻，量控制样本用于估计代表分析过程中遇到的所有分析物的平均轮廓，

(2)用甲醇对血清样本进行处理，然后，离心，

(3)用高效液相色谱-质谱对上清液进行代谢组学分析，样品分析采用Waters ACQUITY超高性能液相色谱系统和W_aters Q-TOF微质量系统进行在正负电离两种模式下进行分析，

(4)原始GC-MS数据的提取、对齐、反冗余后导出为包括变量、观测值和峰值强度的一个峰值数据集文件，并进行进一步的标准化处理，

(5)文件导入到生物统计学软件中，执行偏最小二乘回归分析，

(6)差异代谢物与差异微生物组的斯皮尔曼相关性分析，挖掘肠道微生物组改变对病人血清代谢组的影响，从而进一步分析对神经递质的改变。