[发明专利]一种同时检测酵母所有端粒长度的方法

说明书

一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，属于生物工程技术领域。本方法包括：（1）取酵母细胞的基因组DNA，加入限制性内切酶MmeI在50微升体系中消化过夜；（2）置于0.9%琼脂糖凝胶电泳处理；（3）取凝胶先后放置于0.25M盐酸、变性缓冲液和中和缓冲液中处理并水洗；（4）利用虹吸法将凝胶上的DNA过夜转移至带正电荷的尼龙膜上，利用紫外交联仪进行DNA与带正电荷的尼龙膜共价键交联；（5）地高辛试剂盒标记TG_1‑3探针作DNA印记分析，检测端粒长度。本发明方法首次使用限制性内切酶MmeI切割基因组DNA，可以检测获得全部32个端粒的长度，比现有技术检测17个端粒长度更加全面，有利于后续研究和相关技术的开发和应用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种同时检测酵母所有端粒长度的方法。

背景技术

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是与人类关系最广泛的一种酵母，在现代分子和细胞生物学等基础学科中用作真核模式生物，其作用和地位相当于原核的模式生物大肠杆菌。酵母基因组由16条线性染色体组成，染色体末端为端粒保护结构（由端粒DNA和其上结合的蛋白质组成），共32个，其中17个端粒（TEL02L，TEL04R，TEL05L，TEL05R，TEL06L，TEL07R，TEL08L，TEL08R，TEL09L，TEL10L，TEL12L，TEL12R，TEL13L，TEL14L，TEL15R，TEL16L）的DNA中靠近末端TG_1-3序列的亚端粒区包含有19个Y'元件，12号染色体的左、右臂分别含有2个Y'元件。其余15个端粒为仅包含X元件的端粒（TEL01L，TEL01R，TEL02R，TEL03L，TEL03R，TEL04L，TEL06R，TEL07L，TEL09R，TEL10R，TEL11L，TEL11R，TEL13R，TEL14R，TEL15L）。

现在通用的检测酵母端粒长度的标准方法为利用限制性内切酶XhoI或PstI切割基因组DNA释放最小的染色体端粒末端限制性片段（chromosomal terminal restrictionfragment，TRF），然后利用同位素32P或者地高辛（digoxigenin）标记的端粒序列TG_1-3特异的探针做印记分析检测端粒长度。无论是XhoI还是PstI只能在17个含有Y’元件的端粒上切割Y’元件序列，而不能切割其余的15个端粒的亚端粒序列产生可以测定端粒长度的最小TRF。然而酵母基因组由16条染色体组成，包含32个端粒。目前，尚没有一种简单的可以同时检测酵母的32个端粒的长度的TRF方法。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种同时检测酵母所有端粒长度的方法。本方法通过使用限制性内切酶MmeI切割基因组DNA释放所有32个端粒的最小末端限制性片段并利用地高辛标记的TG_1-3探针做DNA印记分析检测所有端粒的长度。

一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，包括以下步骤：

（1）取酵母细胞的基因组DNA，加入1微升2U限制性内切酶MmeI在50微升体系中消化过夜，得到酵母所有32个端粒的最小末端限制性片段；

（2）置于含有1XTBE缓冲液的0.9%琼脂糖凝胶中电泳分离处理；

（3）电泳完成后，将凝胶浸没于0.25M盐酸中缓慢摇动30min进行脱嘌呤处理，倒去0.25M盐酸后用水洗2次，加入含有1.5 M NaCl和0.5 M NaOH的强碱变性缓冲液，使凝胶浸没缓慢摇动处理30min，倒去强碱变性缓冲液后水洗2次，再加入含有3M NaCl和0.5M Tris-HCl pH7.0的中和缓冲液，使凝胶浸没缓慢摇动处理30min；

（4）利用虹吸法将经步骤（3）处理后的凝胶上的DNA用含有0.3 M NaCl和0.03 M柠檬酸钠的2XSSC缓冲液过夜转移至带正电荷的尼龙膜上，在上述带有DNA的尼龙膜的正面利用紫外交联仪进行能量交联200 mJ/cm² ，10min；