[发明专利]一种同时检测酵母所有端粒长度的方法

权利要求书

1.一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取酵母细胞的基因组DNA，加入1微升2U限制性内切酶MmeI在50微升体系中消化过夜，得到酵母所有32个端粒的最小末端限制性片段；

（2）置于含有1XTBE缓冲液的0.9%琼脂糖凝胶中电泳分离处理；

（3）电泳完成后，将凝胶浸没于0.25M盐酸中缓慢摇动30min进行脱嘌呤处理，倒去0.25M盐酸后用水洗2次，加入含有1.5 M NaCl和0.5 M NaOH的强碱变性缓冲液，使凝胶浸没缓慢摇动处理30min，倒去强碱变性缓冲液后水洗2次，再加入含有3M NaCl和0.5M Tris-HCl pH7.0的中和缓冲液，使凝胶浸没缓慢摇动处理30min；

（4）利用虹吸法将经步骤（3）处理后的凝胶上的DNA用含有0.3 M NaCl和0.03 M柠檬酸钠的2XSSC缓冲液过夜转移至带正电荷的尼龙膜上，在上述带有DNA的尼龙膜的正面利用紫外交联仪进行能量交联200 mJ/cm² ，10min；

（5）利用地高辛试剂盒标记长度为250碱基对的TG_1-3序列探针，做DNA印记分析，检测端粒长度。

2.如权利要求1所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤（1）中50微升体系包含5微摩尔终浓度SAM。

3. 如权利要求1所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤（2）中凝胶的长´宽´高为：18.5cm´15 cm ´1 cm，电泳分离处理条件为：恒压90V，2.6V/cm，30min，再恒压120 V，3.5V/cm，3-3.5h，所述每厘米为正负电极间的距离。

4. 如权利要求1所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤（5）中标记TG_1-3序列探针的方法为：模板量为1微克，加去离子水体积调整为16微升，98℃变性处理5min立即置于冰水浴中2min使模板DNA处于单链状态，1000rpm离心2min后加入试剂盒中标记试剂4微升，37℃温育20小时后，加入2微升0.2 M EDTA在65℃处理10min终止反应后，保存于-20℃备用。

5. 如权利要求1所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤（5）中DNA印记分析方法为：将紫外交联后的膜DNA面朝上，置于杂交管中，杂交炉缓慢转动，60℃进行预杂交处理1-2小时，探针首次使用于98℃处理10min，立即置于冰水浴中10min，倒去预杂交液，加入经过变性冷却的探针使得探针终浓度为25 ng/ml，缓慢转动60℃杂交过夜，期间封闭和结合碱性磷酸酶标记二抗的步骤参考试剂盒条件进行，最后采用终浓度为1%SDS的40 mMpH7.2磷酸缓冲液洗膜2次，每次20min，恒定转速80rpm/min。