[发明专利]用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因及其检测产品在审
| 申请号： | 202010275432.9 | 申请日： | 2020-04-09 |
| 公开（公告）号： | CN111394516A | 公开（公告）日： | 2020-07-10 |
| 发明（设计）人： | 仲从浩;张震;聂东升 | 申请（专利权）人： | 申联生物医药（上海）股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 上海段和段律师事务所 31334 | 代理人： | 李慧;郭国中 |
| 地址： | 200241 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 呼吸道 rna 病毒 pcr 检测 内参 基因 及其 产品 | ||
【说明书】：
本发明提供了一种用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因及其检测产品，所述内参基因为SF3A1基因。本发明还设计了针对内参基因的引物和探针。与美国CDC用的内参基因RNase P(RPP30)及对应引物和探针相比，本发明所设计和筛选的针对本发明内参基因的引物和探针高度特异，仅对mRNA扩增，而不对基因组DNA扩增；并且本发明内参基因在人群中可被稳定检出。
技术领域
本发明涉及呼吸道RNA病毒检测技术领域，具体涉及一种用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因及其检测产品。
背景技术
呼吸道病毒(respiratory virus)感染是导致全球死亡、残疾的最主要原因之一。据统计，上世纪流感病毒致死人数超过1亿人[Eric T Beck,2010]；在5岁以下儿童中，急性下呼吸道感染导致的死因占20％以上，其中尤以肺炎最为严重，占比超过90％[JeanneCarr,2010]。此外，本世纪新型呼吸道病毒频现，如重症急性呼吸综合征病毒(SARS病毒，2002年)、中东呼吸综合症病毒(MERS病毒，2012年)、新型冠状病毒(SARS-COV2病毒，2019年)，严重危害人类生命、导致惨重的社会经济损失。
早期精确诊断呼吸道病毒有利于迅速确定诊疗方案、采取隔离措施控制疫情。目前相关诊断技术较多，包括病毒分离、病毒抗原检测、病毒核酸检测和抗体检测等[Walter,J.M.2018]。呼吸道病毒以RNA病毒为主(见下表1)，其PCR检测方法主要有反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、反转录-普通PCR、反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)、反转录-依赖核酸序列的扩增(RT-NASBA)、反转录-滚环扩增(RT-RCA)、反转录-单引物等温扩增(RT-SPIA)、反转录-依赖解旋酶DNA等温扩增(RT-HDA)、反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)、反转录-链替代扩增(RT-SDA)等基因扩增技术。这些技术都是通过设计相关引物序列，对待检测基因序列的数量进行扩增放大，以促使待测基因被检出。其中，RT-qPCR可特异检测病毒RNA，具备快速、灵敏、特异性高等优势，是当前最常用的诊断技术。
表1呼吸道病毒及对应病毒核酸[Somerville,L.K.2015]
表附注：ss为单链，ds为双链，(+)为正链(单链病毒RNA可直接行使mRNA功能)，(–)为负链(单链病毒RNA需先合成互补链，由互补链行使mRNA功能)
尽管具备多项优势，但假阴性仍是目前PCR检测尤其是RT-qPCR存在的主要问题之一。对新发现的病毒，RT-qPCR结果假阴性的原因可能来自多个方面：1)新发现病毒的病理特性尚不完全清楚，尚无法准确判定合适的病理样本采集位置和采集时间；2)新开发的诊断试剂盒检测灵敏度参差不齐；3)RNA稳定性远低于DNA，而相关诊断实验涉及流程多，包括临床样本采集、样本保存运输、RNA提取、RT-qPCR反应，其中任何一步操作失误导致RNA被降解或者扩增反应失败，都可导致实验假阴性。
内参基因在所有人群中表达水平相近，研究显示，RT-qPCR诊断病原的同时检测样本中内源基因的mRNA，可有效对临床样本采集、样本保存运输、RNA提取、RT-qPCR反应等全实验过程进行质控，排除实验操作失误、试剂故障、反应失败，一定程度上可规避假阴性，提升诊断结果的可靠度。事实上，早在SARS期间，美国CDC就已将内参基因RNase P的P30基因(RPP30)应用于病原RT-qPCR诊断[Shannon L.Emery，2004]，以提升诊断结果的可靠度，该基因及相关引物探针序列一直沿用至今(序列见表2)。在国内，目前普遍采用的质控方式是，在样品运输到实验室后，在核酸提取之前或在RT-qPCR之前加入外源基因或含外源基因的假病毒，该方法并不能有效监控到上游样本采集和运输保藏过程，且增加额外的实验操作步骤和物料成本。
表2内参基因Rnase P的引物和探针
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- 一种高危型人乳头瘤病毒分型检测的引物探针组及其应用、试剂盒及检测方法-202311031128.X
- 张森;李贵喜;李三华;谢夏;郭琴;王少辉;郭曙光;霍清园;李丹阳;张鑫;齐华 - 河南赛诺特生物技术有限公司
- 2023-08-15 - 2023-10-24 - C12Q1/70
- 本发明涉及一种高危型人乳头瘤病毒分型检测的引物探针组及其应用、试剂盒及检测方法。本发明提供的试剂盒中包含特异性引物探针组，并对反应体系进行合理优化，保证了对高危型人乳头瘤病毒分型检测的灵敏度和特异性，使其更加贴合对受试者尿液样本的检测。试剂盒中包含的标准品可以辅助完成对人乳头瘤病毒高危型别进行分型定量检测，搭配不受采样手法的不同而影响质量的尿液样本，能保证细胞量维持在一个相对均衡的水平，使定量检测的结果更有意义。同时，本发明提供的检测方法能够对受检者体内HPV病毒进行定量检测，从而观察受检者体内在一定时间段内病毒型别与载量的变化情况，从而给予临床医生更多帮助，有利于医生出具针对性的治疗方案。
- 一种RT-qPCR检测黄瓜花叶病毒的方法-202311143956.2
- 刘艳梅 - 南昌师范学院
- 2023-09-06 - 2023-10-24 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种RT‑qPCR检测黄瓜花叶病毒的方法，涉及生物技术领域。该方法包括以下步骤：(1)提取得到待检样品的总RNA，之后反转录得到cDNA；(2)以所述cDNA为模板，利用特异性引物对进行RT‑qPCR反应，根据Ct值判断所述待检样品中是否含有黄瓜花叶病毒：当15Ct值35时，为阳性，即为含有所述黄瓜花叶病毒；当Ct值≥35时，为阴性，即为不含有所述黄瓜花叶病毒。本发明针对黄瓜花叶病毒基因组编码外壳蛋白的基因保守区域，设计了特异性强的RT‑qPCR检测引物，并建立了一种高效的RT‑qPCR检测方法，可为黄瓜花叶病毒的准确高效监测防控提供了技术支持。
- 适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法-202210150996.9
- 毛凌峰;孙凯;尹传林;俞晓平 - 杭州柏熠科技有限公司
- 2022-02-18 - 2023-10-24 - C12Q1/70
- 本发明提供一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法，设计针对15种植物检疫病毒的特异引物池，并将特异性多重反转录技术与纳米孔技术相结合，建立针对15种植物检疫病毒的靶向捕获测序方法，具备高灵敏度、高通量、低成本的优点，可实现单次建库测序检测15种植物检疫病毒的目标，可解决目前植物病毒检疫存在的检测通量低、检测目标单一的问题。
- 检测BK病毒的方法和组合物-201910529553.9
- F·陈;L·I·孔;J·陈;M·捷纳提保 - 焦点诊断公司
- 2006-07-25 - 2023-10-24 - C12Q1/70
- 本发明提供了用于快速、灵敏和高度特异性地基于核酸(例如，基于DNA)检测样品中的BK病毒的方法和组合物。一般地，所述方法涉及检测具有BK病毒基因组保守区域的靶序列的靶核酸。本发明也表征了用于本发明方法的组合物和试剂盒，所述组合物包括引物、探针。
- 猫杯状病毒灭活抗原的毒价检测方法及应用-202310790990.2
- 朱旭;郝鹏;张燕红;王艳杰;张海宝;韩冬;李晓燕;孟书丽;赵嘉楠;赵飞飞;高晓宇;吴孟楠;李培艳;燕成义;杨晶;乌恩宝音;海丽丽;段可欣 - 金宇保灵生物药品有限公司;金宇共立动物保健有限公司
- 2023-06-29 - 2023-10-20 - C12Q1/70
- 本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种猫杯状病毒灭活抗原的毒价检测方法及应用。所述猫杯状病毒灭活抗原的毒价检测方法包括如下步骤：使用灭活剂处理猫杯状病毒液，得到灭活抗原液；使用透析袋去除所述灭活抗原液中的灭活剂，得到纯化灭活抗原；所述透析袋的规格为80‑200kd；所述透析袋的透析时间为5‑12h；测定所述纯化灭活抗原的毒价。所述方法通过透析袋透析灭活剂处理后的灭活抗原，能精准的控制灭活剂的处理时间，进而缩短灭活周期。且使用透析袋可以去除灭活剂残留，在进行灭活检验时，不会因为灭活剂残留而影响灭活结果的判定。本发明所述方法无需多次抗原传代，即可获得抗原的灭活检验结果。
- 引物组和探针、试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法-202311144718.3
- 刘志成;勾红潮;沈海燕;张春红;乌日尼乐;聂晶晶;瞿云芝;张建峰 - 广东省农业科学院动物卫生研究所
- 2023-09-06 - 2023-10-20 - C12Q1/70
- 本发明属于生物技术领域，公开了一种引物组和探针，包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1‑6所示的FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB组成的引物组以及如SEQ ID NO：7‑8所示的荧光探针probe和淬灭探针Quencher，该引物组能够对猪流行性腹泻病毒野毒株、疫苗株均进行扩增，对于野毒株的ORF3基因保守区域开发出荧光引物，用于进行荧光的特征性反应，实现了对猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的高特异性、敏感性的快速定量检测。同时，本发明还提供了一种试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法。
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