[发明专利]BRCA1/2突变检测组合物、试剂盒及文库构建方法

说明书

本发明提供了一种BRCA1/2基因突变的组合物，所述组合物包括如SEQ ID NO:1‑92所示的寡核苷酸。使用本发明的组合物可以通过46对引物的2个PCR反应体系扩增BRCA1/2基因以检测突变。成本低，方法简单，样品起始量仅需10ng，同时本发明的组合物涵盖BRCA1/2基因的全部外显子和内含子边界的±20bp，其检测突变更为完全、准确，灵敏度高。本发明还提供了BRCA1/2基因突变的检测试剂盒及BRCA基因文库的构建方法。

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，具体地，涉及一种BRCA1/2基因突变检测组合物、试剂盒及文库构建方法。

背景技术

乳腺癌、卵巢癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤。BRCA1/2是目前研究较为普遍与乳腺癌和卵巢癌发生有密切关联的两个易感基因，在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥着重要作用。研究表明，约2％-6％的女性乳腺癌患者和10％-15％的卵巢癌患者存在BRCA1/2 基因突变。BRCA1/2这两个基因的突变状态与家族性乳腺癌、卵巢癌的发病关系十分密切。与无突变者/普通人群相比，携带BRCA1/2基因突变的个体发展成为乳腺癌和卵巢癌的患病风险和复发风险均显著增加。携带有BRCA1/2基因突变的女性在其一生中最高有87％的可能性发生乳腺癌。BRCA1/2有害突变还可能增加患胰腺癌，胃癌，胆囊和胆管细胞癌，黑色素瘤和前列腺癌等其它风险。因此，对乳腺癌/卵巢癌高风险人群进行BRCA1/2基因检测很有必要。据乳腺癌信息中心(Breast CancerInformation Core,BIC)报道：BRCA1、BRCA2 的基因突变已达3000多种，这些突变分布于整个编码区。最常见的致病突变为移码突变、无义突变等，没有明显的突变热点。大多数突变导致截短蛋白的生成，使得BRCA1、BRCA2蛋白质正常功能的丧失，从而导致肿瘤发生。

携带有BRCA1/2基因致病突变的患者可使用PARP抑制剂杀死肿瘤细胞。阿斯利康的PARP抑制剂奥拉帕尼在美国、欧盟、中国澳门已上市。作为全球第一个口服的卵巢癌靶向抑制剂，铂敏感复发的BRCA1/2突变亚组卵巢癌人群维持治疗的PFS较复用安慰剂组可提高6.9个月。此外，目前还有不少于5种的类似PARP抑制剂也在积极研发当中。检测BRCA可指导含铂化疗方案的疗效：携带BRCA致病突变的上皮卵巢癌患者对铂类为基础的化疗反应显著优于非突变者。携带BRCA致病突变的患者可考虑进一步鉴别其一级亲属罹患卵巢癌(或乳腺癌)的风险，提前制定随访和预防策略。

传统的Sanger测序是目前国内临床检测BRCA1/2基因突变的主要检测手段。从检测灵敏度上讲，Sanger测序一般只能检测20％以上突变率的变异，对 BRCA1/2全部编码序列及邻近内含子序列检测来说，检测通量较低、周期长，单样品检测费用也较高。另外，市面上也有基于高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis，HRM)技术的检测试剂盒，但仅能检测几个已知位点，其作用非常有限。随着高通量测序技术的普及，该技术被应用于越来越多的基因检测项目。常见的靶向高通量测序方法主要包括多重扩增子测序和杂交捕获测序。多重扩增子文库制备方法简单，时间短，成本低，但其扩增子长度限制了测序仪和测序试剂盒的选择，并且其还需要考虑引物的多重性(即PCR 的反应体系)以及引物的对数。

中国发明专利CN107267600A公开了一种多重扩增BRCA基因的方法，其需要26对引物即可以扩增全部外显子区域和部分内含子区域，但是其26对引物需要5个PCR反应体系，方法非常复杂且耗费时间，并且其样品起始量要求高，至少需要60ng DNA。发明专利WO2018036176A1虽然只需要两个PCR反应体系就能完成多重扩增BRCA基因，但是其一共需要117对引物，并且仅能覆盖内含子边界的10个碱基，方法非常复杂且引物成本很高，以及其样品起始量要求较高，需要20ng DNA。中国发明专利CN 110129414A采用多重扩增后连接接头测序，所述方法简单，但其采用单管中短片段多重扩增，其公布的特异性引物显示靶区域限定在BRCA1/2基因的部分外显子片段，不能覆盖 BRCA1/2基因分布的所有外显子编码区。