[发明专利]一种蔗糖磷酸化酶在制备甘油葡萄糖苷中的应用

说明书

本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶在制备甘油葡萄糖苷中的应用，将SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶基因lrsp克隆至枯草芽孢杆菌表达质粒上，构建重组质粒pP43‑lrsp，并将其转化到表达菌株枯草芽孢杆菌WB800中，构建重组菌枯草芽孢杆菌WB800(pP43‑lrsp)。该重组菌经过发酵，分泌型表达蔗糖磷酸化酶。将发酵液经过稀释后直接用于制备2‑αGG，其以蔗糖作为糖基供体，以丙三醇作为糖基化受体，具有催化效率高，生产速率快的特点，30‑40h内催化得到87‑110g/L的2‑αGG，平均生产强度大于2.1g·L^‑1·h^‑1。

(一)技术领域

本发明涉及一种甘油葡萄糖苷的制备，特别一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-甘油葡萄糖苷中的应用。

(二)技术背景

2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)是由各种植物、藻类和异样细菌为适应盐胁迫和干旱等极端条件而产生的相容性溶质，2-αGG是甘油分子上的二号位羟基被葡萄糖基化的产物，即通过糖苷键将一个D-吡喃葡萄糖与甘油的二号位羟基偶联，其结构如图1所示，其化学名为α-D-吡喃葡萄糖基-α-(1-2,2)-丙三醇，是一种有强效保湿、抗衰老、舒缓、修复、细胞激活多功能的活性化妆品原料。2-αGG不仅适用于日常肌肤的护理，而且同样适用于抗疲劳、抗环境压力(如UV辐射、PM2.5缓解污染)、抗衰老、抗敏感性、抗湿疹性等方面；它同时还具有无致龋性，也可以作为一种无致龋性的甜味剂，添加到食品中；而且它还是一种大分子物质的稳定剂，可用于蛋白质药物等的长期保存；此外，研究发现还具有治疗过敏性呼吸系统疾病、保护眼角结膜、降低血糖和控制内脏脂肪积累等人体保健的功效。

蔗糖磷酸化酶(Sucrosephosphorylase，SPase,EC 2.4.1.7)属于糖苷水解酶GH13家族，能够催化葡萄糖基的特异性转移，具备小分子化合物糖基化功能。相比于其他具有转糖苷能力的生物酶来说，蔗糖磷酸化酶具有糖基供体底物廉价易得，糖基受体底物广泛，反应区域选择性高，不水解糖基化产物等优点。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种土壤来源的革兰氏阳性细菌，具有优良的蛋白质分泌能力，被广泛用于工业酶的生产和蛋白质的异源表达。枯草芽孢杆菌作为表达宿主具备以下优点：其在发酵过程中不产生任何内毒素、无致病性，被认为是一种GRAS安全菌株；枯草芽孢杆菌只有一层膜，不具有外膜结构，所以产物可以被分泌到细胞外，极大地简化了产品的后续分离纯化步骤；营养要求低；遗传背景清晰，方便进行基因改造及代谢组学分析；已有大量关于其转录和翻译机制、大规模发酵的信息；无显著密码子使用偏好性等。因为其特有的优势，枯草芽孢杆菌已成为了目前生产各种工业酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的理想宿主菌株。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种蔗糖磷酸化酶在高效制备2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)中的应用，实现生物法一步催化转化，高效生产2-αGG。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)中的应用，所述蔗糖磷酸化酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述的应用方法为：以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液作为催化剂，以蔗糖作为糖基供体，以丙三醇作为糖基化受体，以pH为4.0-9.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-55℃、磁力搅拌条件下反应，反应完全后，获得含2-αGG的反应液，经分离纯化得到2-αGG产品。所述反应体系中，湿菌体含量为5-50g/L(优选5-20g/L)，蔗糖的终浓度为200-500g/L(优选250-400g/L，最优选300g/L)，丙三醇终浓度为20-300g/L(优选90-180g/L，最优选90g/L)。

进一步，所述发酵液先用相应的缓冲液作适当倍数稀释作为催化酶液；再加入蔗糖和丙三醇，缓冲液溶制成反应体系。