[发明专利]一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用。本发明提供的烯酰吗啉半抗原既最大程度地保留了烯酰吗啉的化学结构，又通过化学合成，引入了可以与蛋白质偶联的含氮基团，合成方法简单，产物纯度、得率较高；使用该半抗原作为原料制备适合动物免疫的抗原体系，制备的单克隆抗体特异性、亲和力、抗体效价均较好，可用于制备酶联免疫试剂盒，检测成本低、检测方法快速、高效、准确，适用于蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的现场监控和大量样本筛查。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

烯酰吗啉(Dimethomorph)是一种肉桂酸类化合物的衍生物，1988年首次报道在法国用于防治葡萄霜霉病和马铃薯、番茄晚疫病等，是一种新的防治霜霉属病原真菌病害的高效内吸收杀菌剂，并且对苯酰胺类杀菌剂的抗性和敏感菌株都有较高的活性，在实际应用中，烯酰吗啉是继甲霜灵之后防治卵菌病害的又一种理想杀菌剂，特别适合于苯酰胺类杀菌剂抗病性病原个体占优势的田间进行抗药性治理。

但通过长期的实验室研究发现，烯酰吗啉可以使实验动物发生癌变和基因突变，烯酰吗啉残留超标可能会影响食品安全以及环境安全。

我国于2016年在国标中规定，烯酰吗啉在水果：瓜果类水果(甜瓜除外)最大残留0.2mg/kg。2015年，美国EPA发布终期条例修订烯酰吗啉在草莓中的最大残留限量，经过EPA评估最终将烯酰吗啉在草莓中的限量修订为0.9mg/kg。因此，为了确保食品的安全和对外出口贸易的发展，建立准确可靠，灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。国内外，对于烯酰吗啉的检测方法主要采用气相谱法，气相色谱法精确可靠、灵敏度高，但前处理步骤多，回收率偏低。酶联免疫测定具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备和人员要求低及样品前处理简单等优点，适合现场监控和大规模样本筛选。

发明内容

本发明的目的是提供一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用，以解决现有技术中存在的上述问题。

第一方面，本发明提供了一种烯酰吗啉半抗原，其分子结构式如下式I所示：

第二方面，本发明提供了一种上述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1)以无水乙醇为溶剂，对硝基苯甲酰氯:氯苯:三氯化铝摩尔比为1:1-4.5:1-3，反应温度为75℃，反应时间为1.5h；反应液变粘稠，红棕色，停止反应，加入2M硫酸水溶液处理，抽滤、水洗，将滤饼加入稀氢氧化钠溶液中，加热搅拌，水洗至中性，干燥得黄色粗产品；经热95％乙醇溶解、过滤、重结晶得白色固体即产物1。

优选地，对硝基苯甲酰氯、氯苯和三氯化铝的摩尔比为1:2-3:1-2；

更优选为1:2.5:1.5。

步骤2)采用四氢呋喃溶解膦酰基乙酸三乙酯，冰盐浴控温4℃，分批加入，0.6g的氢化钠，室温反应1h；之后加入步骤1所得产物1的四氢呋喃溶液，滴毕后，40℃反应5h，TLC显示反应完毕，再加入水，静置分层，水层用乙酸乙酯萃取，合并有机相，稀盐酸洗涤后经过无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，剩余黄色油装物中加入乙醇50mL，加热溶解后冷却析晶，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤，60℃干燥得黄色固体即为产物2；其中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.8-1.2:0.6-1.5。

优选地，上述步骤2)中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.9-1.1:0.8-1.1，更优选为1:1:0.92。

步骤3)取步骤2)中所得产物2，采用无水乙醇溶解，室温下加入氢氧化钠，搅拌反应2h；反应结束后加水，用盐酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，脱溶得白色固体，即产物3。