[发明专利]一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种烯酰吗啉半抗原，其特征在于，其分子结构式如下式I所示：

2.一种制备如权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1)以无水乙醇为溶剂，对硝基苯甲酰氯:氯苯:三氯化铝摩尔比为1:1-4.5:1-3，反应温度为75℃，反应时间为1.5h；反应液变粘稠，红棕色，停止反应，加入2M硫酸水溶液处理，抽滤、水洗，将滤饼加入稀氢氧化钠溶液中，加热搅拌，水洗至中性，干燥得黄色粗产品；经热95％乙醇溶解、过滤、重结晶得白色固体即产物1，

步骤2)采用四氢呋喃溶解膦酰基乙酸三乙酯，冰盐浴控温4℃，分批加入，0.6g的氢化钠，室温反应1h；之后加入步骤1)所得产物1的四氢呋喃溶液，滴毕后，40℃反应5h，TLC显示反应完毕，再加入水，静置分层，水层用乙酸乙酯萃取，合并有机相，稀盐酸洗涤后经过无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，剩余黄色油状物中加入乙醇50mL，加热溶解后冷却析晶，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤，60℃干燥得黄色固体即为产物2；其中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.8-1.2:0.6-1.5，

步骤3)取步骤2)中所得产物2，采用无水乙醇溶解，室温下加入氢氧化钠，搅拌反应2h；反应结束后加水，用盐酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，脱溶得白色固体，即产物3，

步骤4)取步骤3)中所得产物3，二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺溶解在乙酸乙酯中，室温搅拌反应8h，离心去沉淀，向上清液中加入吗啉，搅拌反应3h；反应结束后，用水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除乙酸乙酯，得产物4；其中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比1:0.8-2:0.8-2:0.5-2，

步骤5)称取铁粉，加入到90℃盐酸的水溶液中，不断搅拌，1h后，加入步骤4)所得产物4，加热到95℃，反应4h，调节pH在8-9，然后加入活性炭继续搅拌40min，趁热过滤，滤液倒入烧杯中冷却结晶，滤饼用热的乙醇洗涤三次合并滤液，然后倒入冷水中，晶体自然析出；得淡黄色固体，真空干燥，称重，得固体，即为烯酰吗啉半抗原

3.根据权利要求2所述的制备如权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其中，在步骤1)中，对硝基苯甲酰氯、氯苯和三氯化铝的摩尔比为1:2-3:1-2；在步骤2)中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.9-1.1:0.8-1.1；在步骤4)中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比为1:0.9-1.5:0.9-1.5:0.9-1.5。

4.根据权利要求2所述的制备如权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其中，在步骤1)中，对硝基苯甲酰氯、氯苯和三氯化铝的摩尔比为1:2.5:1.5；在步骤2)中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:1:0.92；在步骤4)中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比为1:1.2:1.2:1。

5.一种烯酰吗啉人工抗原，其特征在于，其通过权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原与载体蛋白交联获得，所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。

6.一种制备如权利要求5所述的烯酰吗啉人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)取权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原50mg用稀盐酸溶解，滴加1.5％亚硝酸钠溶液，冰浴下持续搅拌；溶液变成蓝黑色后，停止加入亚硝酸钠溶液，继续反应15min；

步骤2)滴加到浓度为10-20mg/mL的载体蛋白溶液，搅拌，调节pH至10，2-8℃下反应3h，透析3天，即得烯酰吗啉抗原，其中，烯酰吗啉半抗原与载体蛋白的摩尔比为10-70:1；其中，所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白或卵清蛋白。

7.一种如权利要求6所述的烯酰吗啉人工抗原的制备方法，其特征在于，所述的烯酰吗啉半抗原与载体蛋白的摩尔比为20-60:1。