[发明专利]一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法及其应用

说明书

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法及其应用。本发明用核酸质谱技术，检测结直肠癌相关的5个基因15个区域的特定组合，定量分析这15区域中近120个CpG位点的DNA甲基化程度，建立CRC病人特征性的DNA甲基化谱。本发明通过核酸质谱技术对基因甲基化进行检测，相比于TaqMan‑PCR和二代平台测序，该检测方法具有简便、灵活性强，高通量大、成本低等特点。本发明除可用于CRC的早期评估和大规模筛查，为CRC患病风险评估、诊断提供重要参考依据，以实现对结直肠癌疾病的早期预警。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法及其应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，大城市的情况尤其严峻，结直肠癌早已超越胃癌成为消化系统的首要恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤中，结直肠癌的发病率和死亡率均仅次于肺癌居第2位。虽然结直肠癌的治疗在近年有了长足的进步，但总体疗效并没有很大的改善，手术后的5年生存率在50％左右。而结直肠癌的早期患者治疗效果较好，5年生存率可在90％以上。导致CRC发病的因素主要包括环境和遗传。通过对CRC的基因突变进行检测，可以提前预知CRC患病的风险，对CRC的早期诊断和有效预防具有重大的指导意义。在早期的CRC中，肿瘤细胞可能脱落进入肠腔，并与粪便混合，由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，因此从粪便样本中提取DNA稳定性和敏感性更高。

CRC有多种早期检测的方法，包括以粪便为基础的检查如粪便隐血试验(FOBT)、粪便免疫化学试验(FIT)；内镜检查如柔性乙状结结肠镜检查、结肠镜和胶囊内镜检查；影像检查如结肠气钡双重造影、结肠CT成像等。结肠镜检查是CRC筛查的“金标准”，但是在检查前需要对患者做禁食、服用泻药等准备，检查过程又属于侵入性的检查方式，过程长且痛苦，还有穿孔等高风险的并发症可能，因此不易被患者接受，也难以作为CRC的早期筛查手段。FOBT及FIT试验属于无创检测手段，但是其敏感性和特异性均较低，需要重复试验的验证，且检查结果易受药物等因素的影响而产生假阳性，只能作为初筛手段。

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。因此通过甲基化检测可判断CRC患病的风险。

与CRC的发生明确相关的DNA甲基化基因标志物有多个，本发明选择其中BMP3、NDRG4、SDC2、SFRP2、VIM等，分别检测各基因中的3个区域的DNA甲基化模式，鉴别结直肠癌。

目前常用的检测DNA甲基化的方法主要是采用TaqMan-PCR及其二代平台测序，但是其存在诸如设计的灵活性不够、检测容量小、成本高的问题。本项目选择在MassRRAY飞行质谱仪(MALDI-TOF)技术平台上开发一套检测粪便基因DNA甲基化的方法，早期发现CRC和CRC的癌前病变腺瘤。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种基于核酸质谱技术，利用基因DNA甲基化模式，鉴别结直肠癌的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其包括如下步骤：

(1)筛选出用于评估个体罹患结直肠癌风险相关的基因和基因中的DNA甲基化区域；

(2)设计步骤(1)中结直肠癌基因的特异性扩增引物，设计引物扩增的DNA片段不超过200bp；