[发明专利]一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)筛选出用于评估个体罹患结直肠癌风险相关的基因和基因中的DNA甲基化区域；

(2)设计步骤(1)中结直肠癌基因的特异性扩增引物，设计引物扩增的DNA片段不超过200bp；

(3)对待测DNA样本进行重亚硫酸盐转化；

(4)将步骤(2)中，所有引物由7位编号表示，编号由字母和数字组成，第1到6位数字和字母相同的引物为一对，第7位是字母F或者R，每对引物的上下游引物等摩尔混合，得到相应的扩增引物混合液，每对扩增引物混合液的最终工作浓度为1μM；

(5)以重亚硫酸盐转化后的DNA样本为模板，利用步骤(4)中的扩增引物分别进行PCR扩增反应，获得目的基因的PCR产物片段；

(6)SAP反应消化步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；

(7)对步骤(6)完成SAP消化后的DNA样本进行T Cleavage转录及T切；

(8)洁净树脂脱盐纯化步骤(7)完成T Cleavage转录及T切的产物；

(9)MassARRAY平台对结直肠癌风险相关性基因的DNA甲基化位点定量检测，确定每个CpG位点的甲基化程度。

2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(1)中，可用来评估个体罹患结直肠癌风险相关性的基因为BMP3、NDRG4、SDC2、SFRP2、VIM。

3.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述个体罹患结直肠癌风险相关性基因的DNA甲基化位点定量检测的PCR特异性扩增引物对为：M00101F，M00101R；M00102F，M00102R；M00103F，M00103R；M00201F，M00201R；M00202F，M00202R；M00203F，M00203R；M00301F，M00301R；M00302F，M00302R；M00303F，M00303R；M00401F，M00401R；M00402F，M00402R；M00403F，M00403R；M00501F，M00501R；M00502F，M00502R；M00503F，M00503R。

4.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的重亚硫酸盐转化的循环条件为：(95℃30s→50℃15min)×20cycles→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。

5.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的PCR扩增条件为：95℃4min→(95℃20s→56℃30s→72℃1min)×45cycles→72℃3min→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。

6.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(6)中，所述的SAP消化的循化条件为：37℃20min→85℃5min→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。

7.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(7)T Cleavage转录及T切的循化条件为：37℃3h→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。

8.权利要求1-7任意之一所述基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或者是否具有形成结直肠癌的风险的制剂中的用途。