[发明专利]一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用

说明书

本发明公开了一种胞内外分泌4‑α‑糖基转移酶(4GT)的基因工程菌(重组大肠杆菌)，属于酶基因工程和酶工程领域。所述基因工程菌通过将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT的基因通过质粒pET‑32a(+)导入到宿主细胞大肠杆菌中得到。本发明构建的基因工程菌株的胞外4GT酶活可达到167.47U/mL。该重组酶的最适温度为60℃，最适pH为7.0，所述4GT具有转苷活性，能使淀粉中支链淀粉的侧链长度延长，适合食品、化妆品和医药等工业应用的需要，能用于高支化淀粉的工业生产。本发明的优点在于以大肠杆菌为宿主，4GT不仅在其胞内进行了表达，而且在其胞外也能高效表达，这不仅减少了杂蛋白对4GT酶活及4GT纯化时的干扰，也可简化生产4GT的流程。

技术领域

本发明属于酶基因工程和酶工程领域，涉及一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用。

背景技术

来自嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8，ATTC27634)的4-α-糖基转移酶(4-α-glycosyltransferase，简称4GT，EC 2.4.1.25)作用于淀粉，可断裂其α-1,4糖苷键，形成新的α-1,4糖苷键，致直链淀粉或支链淀粉的主链被分解，而支链淀粉的侧链长度将延长。与普通淀粉相比，这种被4GT改性过的淀粉，其回生特性改善，抗消化性提高，溶解性也增加，并且具有热可逆凝胶特性。这些性质提示4GT在食品、化妆品和医药等领域有较大的应用前景。

目前应用的4GT主要来源于细菌，已发现嗜热放线菌，牛链球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、栖热水生菌、海栖热袍菌、超嗜热古菌和嗜热栖热菌等多种细菌可产4GT。其中，源自嗜热栖热菌HB8的耐热4-α-糖基转移酶制剂4GT由于拥有催化效率高、酶促反应温度高，热稳定性好、底物范围广等独特优势，使得该菌在发酵工业上有着良好的应用前景。其中开发并应用嗜热酶成为国内外研究的焦点。

由于原有微生物体内4GT含量普遍较低，且提取困难，故实际生产应用中比较重视开发4GT基因工程菌。

大肠杆菌由于拥有遗传背景清楚、繁殖快和成本低等优点，是发展最早和应用最广泛的经典表达系统。4GT蛋白在大肠杆菌中是以胞内可溶性的形式表达，在利用大肠杆菌生产4GT蛋白时，需要对细胞进行破壁处理才能获得，不利于重组4GT的回收和使用。且4GT酶活普遍较低，胞内4GT纯化困难，这些均限制了其工业化应用。因此，实现4GT在大肠杆菌中的胞外分泌，简化制备4GT的流程，减少杂蛋白对4GT活性的影响对于工业化应用具有重要影响；通过优化其重组菌的发酵条件，如培养基成分、培养基pH、培养温度、接种量、装液量、诱导时间和IPTG浓度，以期提高4GT重组蛋白的胞外分泌，对推动4GT的工业化应用具有重要意义。

发明内容

本发明克服现有技术的上述缺陷，提供了一种4-α-糖基转移酶的克隆与高效表达方法。本发明提出了一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌(重组大肠杆菌)，通过将来源于嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8)的编码4GT的基因通过质粒pET-32a(+)导入大肠杆菌中得到。所述基因工程菌能够在胞内外高效分泌4GT。

其中，所述编码4GT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述基因工程菌的胞内与胞外均能分泌4GT。由已有报道可知，4GT在大肠杆菌克隆菌株中的表达几乎全部为胞内表达。而本发明中的4GT，在无外在信号肽的介导下，不仅在其胞内成功表达，且能以有活性的形式分泌至胞外，且在胞外进行高效表达。而这种胞外分泌4GT的形式，不仅减少了胞内杂蛋白对4GT酶活的干扰，也简化了生产4GT的流程。