[发明专利]一种新型病原微生物检测的方法

说明书

本发明公开了一种新型病原微生物检测的方法，包括：脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤；外周血样本采集步骤；DNA提取步骤，取400ul样本用于检测，样本中加入反应试剂buffer GB、Lysis Enzyme K、RNA Carrier，56℃下反应10min，获得反应液；反应液经硅胶膜吸附柱纯化，去除盐离子及有机试剂，得到总量、纯度符合要求的DNA；文库构建步骤，所述DNA由末端修复、接头连接、文库扩增富集、纯化、质控步骤处理，完成文库构建；测序步骤，文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，利用Illumina SBS测序方法读取序列，获得测序数据；分析步骤，所述测序数据经数据过滤、去除人源及接头序列，剩余数据与微生物参考数据库比对。

技术领域

本发明涉及分子生物学和分子遗传学领域，尤其涉及基于新一代测序技术的一种新型病原微生物检测的方法。

背景技术

传统的病原微生物鉴定技术主要分为两类：基于细胞培养的方法例如形态学观察、细胞生理生化特征、细菌培养分型、基因芯片、自动化微生物分析系统等，和基于特异引物/探针/抗体的方法例如抗原抗体反应、PCR反应检测以及各种特异性的病原微生物快速检测系统等。这些技术在日常病原微生物确证中发挥了重要作用，但也存在一定的不足，如前者需要依赖培养、周期长、鉴定精度低，后者需要一定的微生物序列先验知识、无法应对未知或突变病原体等。

因此，病原微生物基因组测序逐渐成为临床微生物检测领域的重要工具与手段，但是，当前对于病原微生物的检测方法比较匮乏，难以准确检测样本中微生物的种类。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

基于上述原因，本申请人提出了一种新型病原微生物检测的方法，旨在克服上述问题，检测血液、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液等样本，可准确检测样本中微生物的种类。

发明内容

为了满足上述要求，本发明的的在于提供一种新型病原微生物检测的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种新型病原微生物检测的方法，包括：

脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤，使用2ml或5ml无菌冻存管收集样本，干冰保存，所述样本量大于1ml；

外周血样本采集步骤，使用EDTA抗凝管或STRECK采血管收集外周血5ml，生物冰袋或4℃以下保存，8h内分离血浆，实施检测前进行血浆分离流程；

DNA提取步骤，取400ul样本用于检测，样本中加入反应试剂buffer GB、LysisEnzyme K、RNA Carrier，56℃下反应10min，获得反应液；反应液经硅胶膜吸附柱纯化，去除盐离子及有机试剂，得到总量、纯度符合要求的DNA；

文库构建步骤，所述DNA由末端修复、接头连接、文库扩增富集、纯化、质控步骤处理，完成文库构建；

测序步骤，文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，利用Illumina SBS测序方法读取序列，获得测序数据；

分析步骤，所述测序数据经数据过滤、去除人源及接头序列，剩余数据与微生物参考数据库比对，鉴定出样本中的细菌、真菌、病毒、寄生虫微生物。

本发明的检测方法主要用于提取脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、血浆、胸腹水等样本中循环游离DNA，并直接对提取的DNA进行建库，分析其中可能的病原微生物。

进一步技术方案为，所述脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤与外周血样本采集步骤还包括以下样品保存方法：