[发明专利]一种新型病原微生物检测的方法

权利要求书

1.一种新型病原微生物检测的方法，其特征在于，包括：

脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤，使用2ml或5ml无菌冻存管收集样本，干冰保存，所述样本量大于1ml；

外周血样本采集步骤，使用EDTA抗凝管或STRECK采血管收集外周血5ml，生物冰袋或4℃以下保存，8h内分离血浆，实施检测前进行血浆分离流程；

DNA提取步骤，取400ul样本用于检测，样本中加入反应试剂buffer GB、Lysis EnzymeK、RNA Carrier，56℃下反应10min，获得反应液；反应液经硅胶膜吸附柱纯化，去除盐离子及有机试剂，得到总量、纯度符合要求的DNA；

文库构建步骤，所述DNA由末端修复、接头连接、文库扩增富集、纯化、质控步骤处理，完成文库构建；

测序步骤，文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，利用Illumina SBS测序方法读取序列，获得测序数据；

分析步骤，所述测序数据经数据过滤、去除人源及接头序列，剩余数据与微生物参考数据库比对，鉴定出样本中的细菌、真菌、病毒、寄生虫微生物。

2.根据权利要求1所述的一种新型病原微生物检测的方法，其特征在于，所述脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤与外周血样本采集步骤还包括以下样品保存方法：

步骤a.除RNA Carrier外，其余试剂在15-25℃干燥条件下；

或，保存于4-8℃条件下，使用前在室温放置以溶解沉淀；

步骤b.RNA Carrier，浓度为1ug/ul，采用分装处理，保存温度为-20℃，反复冻融次数不超过三次；

步骤c.试剂所需的缓冲液GD、漂洗液PW使用前加入无水乙醇；

步骤d.避免试剂的反复冻融；

步骤e.将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离，并使用移液器定时实验区域进行清洁；

步骤f.所述血浆分离流程过程中，加入样本涡旋后均对样本进行短暂离心，以离心管壁上的残余液体；

步骤g.PCR反应管从PCR仪器中拿下后，短暂离心处理，用于将管壁和管盖上的液体离心到管底。

3.根据权利要求1所述的一种新型病原微生物检测的方法，其特征在于，所述血浆分离流程包括：

高速冷冻离心机预冷至4℃；

将含全血样本的2ml离心管，置预冷离心机1600g离心10min；

离心后将所述离心管中的上清转移至新的无菌2ml离心管中，使用离心机进行16000g离心10min；

离心结束后将所述上清转移至新的无菌2ml离心管中，取400ul用于检测，剩余样本-80℃冻存。