[发明专利]4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用

说明书

本发明属于生物技术和发酵领域，具体涉及4‑氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用。本发明以质粒T2(2)‑Ori为基础，通过构建4‑氨基丁酸氨基转移酶基因gabT的敲除载体T2‑△gabT，成功在解淀粉芽胞杆菌LX‑12中敲除了gabT基因，得到了解淀粉芽胞杆菌工程菌LX‑12△gabT。与对照菌LX‑12相比，工程菌株LX‑12△gabT的IturinA产量至少提高了30%以上。

技术领域

本发明属于生物技术和发酵领域，具体涉及4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用。

背景技术

伊枯草菌素(IturinA)是主要由枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌合成产生的一种环脂肽，其分子结构包含由七个氨基酸残基组成的肽链和一条β-氨基脂肪酸侧链,氨基酸组成包括天冬酰胺(Asn)，谷氨酰胺(D-Gln)，丝氨酸(L-Ser)，脯氨酸(L-Pro)，酪氨酸(D-Tyr)，因其表现出很强的抗菌活性与溶血活性，对环境友好，所以在植物病害的生物防治等诸多领域有着非常重要的价值。脂肽类抗生素主要应用于农业生物防治、医药、石油开采、食品保藏、环境治理及化妆品等领域。

基因gabT编码4-氨基丁酸氨基转移酶，它是合成1-脱氧野尻霉素的途径基因。

目前尚无4-氨基丁酸氨基转移酶可对伊枯草菌素A的产量相关的报道。本申请通过敲除解淀粉芽胞杆菌中4-氨基丁酸氨基转移酶基因gabT，使得IturinA的产量有大幅度提升。为IturinA高产提供一种新的策略。

发明内容

本发明的目的在于提供了4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用，包括利用本领域的常规方案，将解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的4-氨基丁酸氨基转移酶基因敲除、沉默或降低表达；即可提高该菌株的伊枯草菌素A的产量。

以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为解淀粉芽胞杆菌LX-12，保藏编号为CCTCC NO：M2015234。

以上所述的应用中，所述的4-氨基丁酸氨基转移酶的基因为SEQ ID NO.1所示。

以上所述的应用中，优选的，当采用基因敲除的方式时，包括下述步骤：

(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出gabT基因的上游同源臂和gabT基因的下游同源臂；

(2)通过重叠延伸PCR将gabT基因的上游同源臂和gabT基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：gabT基因的上游同源臂-gabT基因的下游同源臂；

(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

(4)将步骤(2)得到的酶切目的片段和步骤(3)得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-△gabT；

(5)将敲除质粒T2(2)-△gabT转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，筛选即得缺失了gabT基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12△gabT。