[发明专利]一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒。本发明利用数字聚合酶链式反应(dPCR)技术对生物样本中HBV DNA进行定量检测，可用于监测乙型肝炎患者的HBV DNA基线水平和变化情况、评估抗病毒治疗的应答和治疗效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种可导致病毒性肝炎的病原体。据世界卫生组织统计，全球约有20亿人有HBV感染史，其中2.4亿人患有慢性乙型肝炎；每年约65万人死于有慢性乙型肝炎导致的肝脏衰竭、肝硬化、肝细胞癌。全球30％的肝硬化和45％的肝细胞癌的病因是HBV感染；在中国，60％的肝硬化和80％的肝细胞癌的病因是HBV感染。

血清学检测通常作为HBV感染的诊断、治疗和预后评估的重要指标，如：HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe、anti-HBc和anti-HBc-免疫球蛋白M。但最直接、最可靠的病毒复制检测方法是血清或血浆HBV DNA定量测定。HBV DNA检测阳性提示HBV复制、有传染性，HBV DNA定量检测指标越高表示病毒复制越活跃、传染性越强。DNA定量检测和监测可帮助了解机体内病毒的数量、复制水平、传染性、药物治疗效果和制定治疗策略。作为评估指标，HBV DNA定量检测也是唯一能够帮助确诊隐匿性HBV感染的实验室检测指标。因此，HBV DNA定量检测是一种有着重要临床意义的技术手段，可与血清学检测联合应用于对HBV感染者的管理。

HBV DNA定量检测的常用方法是核酸扩增技术。目前有很多公司研发出通过实时荧光PCR(qPCR)定量检测血清或血浆中HBV病毒载量的试剂盒。受qPCR定量检测技术原理的限制，这一技术对核酸的定量检测依赖一组定量标准品的平行检测和比对。同时，qPCR定量检测低浓度样本时的准确性和精密度不高。另外，由于qPCR定量检测受到许多影响扩增效率的因素所影响，因而其准确性、一致性均不理想，检测结果难于标准化。这些影响扩增效率的因素包括：HBV DNA样本中的PCR抑制剂、用于扩增的PCR引物序列、HBV的基因型和变异株等。

数字PCR(dPCR)是一种绝对定量技术，其定量检测不依赖于定量标准品；同时，dPCR对PCR抑制剂的耐受性更高。此外，由于其定量检测对扩增效率的依赖性低，dPCR对HBV不同基因型和变异株的检测具有更高的准确性、一致性。因此，HBV DNA的dPCR定量检测是qPCR定量检测的技术升级，并在未来有希望替代HBV DNA的qPCR定量检测。目前商用试剂盒均为在qPCR仪上应用的产品，无法直接应用于数字PCR，因此，需要一种经优化的、适用于dPCR的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒，所述试剂盒在数字PCR法中使用。

具体地，本发明涉及如下内容：

1.一组用于特异性扩增乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)引物，其特征在于，所述引物包括正向引物，其中所述正向引物包括：SEQ ID NO.:1和/或和SEQ ID NO.:2所示的引物。

2.根据第1项所述的一组数字PCR(dPCR)引物，其特征在于，所述引物还包括反向引物，其中所述反向引物包括：SEQ ID NO.:3所示的引物。

3.一组用于特异性检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)探针，其特征在于，所述探针包括：SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示的探针。

4.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)反应预混物，其特征在于，所述数字PCR(dPCR)反应预混物包括正向引物、反向引物和探针，其中，

所述正向引物包括：SEQ ID NO.:1和/或SEQ ID NO.:2所示的引物，