[发明专利]一种利用谷胱甘肽过氧化物酶4评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法

权利要求书

1.一种利用谷胱甘肽过氧化物酶4评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法，利用人体外周血AHH1淋巴细胞中GPX4对低剂量伽马射线辐射非常敏感的特性，根据人体外周血AHH1淋巴细胞接受的低剂量伽马射线辐射剂量与GPX4的相对表达量的上调率的剂量-效应关系，通过检测人体外周血AHH1淋巴细胞中GPX4的相对表达量的上调率，评估低剂量伽马射线辐射对人体血液的生物损伤，

具体步骤是：

(1)人体外周血AHH1淋巴细胞的培养；人体外周血AHH1淋巴细胞编号ATCC CRL-8146；

(2)伽马射线辐射；

(3)GPX4的相对表达量上调率的检测；

(4)辐射损伤综合评价；

其进一步的措施是：

所述的人体外周血AHH1淋巴细胞的培养具体方法为：

人体外周血AHH-1淋巴细胞，用含10％血清培养液中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱，每隔3天换一次培养液，每隔3-5天进行一次细胞传代，取对数生长期细胞进行实验，所述的伽马射线辐射具体方法为：

采用细胞计数仪将细胞密度调整为6×10⁵细胞/ml，再取用6×10⁶个细胞即10ml细胞溶液，将其移至新培养瓶，放在剂量率为14μGy/h的伽马射线下进行长时间持续辐照，分别收集持续辐照0、7、21、42和56天，辐照剂量分别为0、2.4、7.2、14.1和18.8mGy，的外周血AHH1淋巴细胞，

所述GPX4的相对表达量上调率的检测具体方法为：

将收集的受过低剂量伽马射线辐照的外周血AHH1淋巴细胞进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后进行GPX4的相对表达量上调率分析，

所述蛋白提取具体步骤如下：

倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS平放轻轻摇动1min洗涤，然后弃去洗液，重复以上操作两次，共洗三次以洗去培养液，将PBS弃净后把培养瓶置于冰上，1ml裂解液加10ulPMSF，摇匀置于冰上，每瓶加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动，裂解完后，移至离心管，离心5min，上清于离心管保存，

所述的总蛋白浓度测定的具体步骤如下：

将0.2mg/ml BSA标准品溶液加稀释液依次稀释成0、5、10、20、50、100、150和200μg/ml的标准品溶液，然后测定它们在562nm下的吸光度值，绘制标准曲线，测定每个样品溶液562nm下的吸光度值后，最后通过标准曲线计算出样品中蛋白质的浓度，

所述的蛋白质变性的具体步骤如下：

将蛋白质溶液按照4:1的比例加入5×蛋白质上样缓冲液，沸水浴变性15min，放入-20℃冰箱保存备用，

所述的凝胶电泳的具体步骤如下：

将30％丙烯酰胺、1.5M TRIS－HCl、10％SDS、AP和TEMED按照一定比例配制成10％的分离胶和5％的浓缩胶，等分离胶凝固好后，在电泳槽中加入电泳液后，将变性后蛋白质样品加入电泳孔中，进行电泳，将浓缩胶电压调至75V，分离胶电压调至120V，电泳至溴酚蓝刚跑至分离胶底部，即可终止电泳，进行转膜，

所述的转膜的具体步骤如下：

先采用甲醇将PVDF膜进行活化，再在膜的底部放置6张7×9cm的滤纸，再一同放置于转膜仪中，加入转膜液，300mA恒流转膜半小时，转膜过程中，将转膜槽放置于冰水中降温，

所述的免疫反应的具体步骤如下：

将转好的膜用5％的脱脂牛奶封闭，5％的脱脂牛奶用0.5％TBST稀释，在脱色摇床上混匀1h，采用TBST溶解的5％脱脂牛奶对GPX4一抗进行1:100浓度稀释，然后将其与封闭好的膜进行混匀，4℃孵育过夜，用2％TBST对GPX4一抗孵育过夜的膜进行清洗，室温下，在脱色摇床上清洗三次，每次5min，最后用TBST对二抗稀释3000倍，室温下孵育30min后，在脱色摇床上清洗三次，每次5min，

所述的化学发光反应的具体步骤如下：

在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上，加入混合好的ECL溶液充分反应1-2min后，放入凝胶成像系统进行扫描分析，

所述的凝胶成像扫描分析的具体步骤如下：

采用凝胶成像系统对蛋白条带进行拍照，再采用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，通过对GPX4蛋白灰度值扫描获得GPX4蛋白表达量，对内参蛋白GAPDH蛋白灰度值扫描获得GAPDH蛋白表达量；将GPX4蛋白表达量除以内参蛋白GAPDH蛋白表达量获得了GPX4相对表达量，

所述的GPX4的相对表达量上调率分析的具体步骤如下：

所述辐射损伤综合评价的方法是：

采用GPX4相对表达量上调率来评估低剂量伽马射线辐射对人体外周血的生物损伤，当人体外周血AHH-1淋巴细胞中的GPX4相对表达量上调率小于10％时，表明低剂量伽马射线辐射对人体外周血无损伤；当人体外周血AHH-1淋巴细胞GPX4相对表达量上调率大于10％而小于30％时，此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为Ⅰ级；当人体外周血AHH-1淋巴细胞中的GPX4相对表达量上调率大于30％而小于60％时，此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为Ⅱ级；当人体外周血AHH-1淋巴细胞中的GPX4相对表达量上调率大于60％时，此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为Ⅲ级。

2.根据权利要求1所述的一种利用谷胱甘肽过氧化物酶4评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法，其特征在于，所述损伤等级Ⅰ级损伤程度低于损伤等级Ⅱ级，损伤等级Ⅱ级损伤程度低于损伤等级Ⅲ级。