[发明专利]细胞分子的原位组合标记

权利要求书

1.一种独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法，所述方法包括：

(a)在步骤(b)之前固定和透化第一多个细胞，其中在约8℃以下固定和透化所述第一多个细胞；

(b)逆转录所述第一多个细胞内的RNA分子以在所述第一多个细胞内形成互补DNA(cDNA)分子，其中逆转录所述RNA分子包括将引物偶联到所述RNA分子，其中所述引物包含聚(T)序列或随机序列中的至少一种；

(c)将所述包含cDNA分子的第一多个细胞分成至少两个初级等分试样，所述至少两个初级等分试样包括第一初级等分试样和第二初级等分试样；

(d)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；

(e)将所述至少两个初级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的初级核酸标签偶联；

(f)合并所述至少两个初级等分试样；

(g)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括第一次级等分试样和第二次级等分试样；

(h)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不同于向所述第二次级等分试样提供的次级核酸标签；

(i)将所述至少两个次级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的次级核酸标签偶联；

(j)用随后的等分试样重复步骤(f)、(g)、(h)和(i)，其中最后的核酸标签包含捕获剂；

(k)合并最后的等分试样；

(l)裂解所述第一多个细胞以从所述第一多个细胞内释放cDNA分子，以形成裂解物；和

(m)向所述裂解物添加蛋白酶抑制剂和结合剂，以使所述cDNA分子结合结合剂。

2.权利要求1所述的方法，其还包括将所述合并的最后的等分试样分成至少两个最后的等分试样，所述至少两个最后的等分试样包括第一最后的等分试样和第二最后的等分试样。

3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在约7℃以下、在约6℃以下、在约5℃以下、在约4℃以下、在约3℃以下、在约2℃以下或在约1℃以下固定和透化所述第一多个细胞。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟(PMSF)或4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包括生物素，并且其中所述结合剂包括亲和素。

6.权利要求5所述的方法，其中所述结合剂包括链霉亲和素。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括：

(n)对所述与结合剂结合的cDNA分子进行模板转换；

(o)扩增所述cDNA分子以形成扩增的cDNA分子溶液；和

(p)将固相可逆固定化(SPRI)珠溶液引入所述扩增的cDNA分子溶液中，以去除小于200个碱基对的多核苷酸，其中SPRI珠溶液与扩增的cDNA分子溶液之比为约0.9:1至约0.7:1。

8.权利要求7所述的方法，其中SPRI珠溶液与裂解物之比为约0.875:1至约0.775:1，约0.85:1至约0.75:1，或约0.825:1至约0.725:1。

9.权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述SPRI珠溶液包含约2M至3M NaCl和约15％w/v至25％w/v的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。

10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其还包括：

将共用衔接子序列添加到所述释放的cDNA分子的3’端，其中所述添加是在包含最多约10％w/v的聚乙二醇的溶液中进行的，并且其中所述聚乙二醇的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。