[发明专利]一种核酸测序方法以及一种核酸测序试剂盒

说明书

一种核酸测序方法和一种核酸测序试剂盒，所述试剂盒包含核酸探针，连接酶，3'端连接有阻断基团的dNTP，聚合酶，用于切除连接在dNTP的3'端的阻断基团的试剂1，和用于切除核酸探针上未与被测碱基结合的其余核苷酸的试剂2。

技术领域

本发明属于基因测序领域，涉及一种核酸测序方法以及一种核酸测序试剂盒。具体地，所述核酸测序方法为DNA测序方法。具体地，所述核酸测序试剂盒为DNA测序试剂盒。

背景技术

连接测序法由Complete Genomics和ABI两家公司分别开发出来，采用不同的形式展现，基本原理都是通过连接酶连接上荧光修饰的DNA探针。该DNA探针在某些位置为特定碱基以识别待测序列，其余位置为随机序列可以和其它待测位置形成互补链。连接反应之后，去掉未连接的探针，之后通过光学手段检测连接上的探针信号而确定该位置的序列。

Complete Genomics采用以不同的荧光基团分别标记4个不同碱基的探针。第一组探针的5’端的第1个位置分别为4个不同的碱基，之后的碱基为随机序列从而可以结合到待测的随机序列上，通过连接酶连接到引物序列之后，检测荧光获得该位置的碱基信息。去掉加上的序列，加入新的测序引物之后进行第二组探针的杂交和连接，第二组探针的5’端第2个位置分别为4个不同的碱基，其它位置为随机序列，在这之后进行检测第2个位置的荧光分子从而确定第2位置的序列。类似地，分别确定第3-8位置的碱基序列。一共使用8组探针，确定前八个碱基序列，之后加入更长的新的测序引物开展后面8个碱基的测序。

ABI的连接测序法被称为Sequencing by Oligonucleotide Ligation andDetection(SOLiD)，采用16组不同的探针，每组探针的前面2个为固定序列，后面三个碱基为随机序列，之后三个碱基为通用碱基，在随机碱基和通用碱基(第5和第6)连接的方法为O-P-S，以上序列既可以从5’端开始排序也可以从3’端开始排序。如下面的式I所示，如果从5’端排序，随机碱基3’端为氧原子，第一个通用碱基5’端为硫原子。从3’端排序则相同，第3个随机碱基的5’端为氧原子，第一个通用碱基的3’端为硫原子。

测序从3’端向5’端方向，加上测序引物，使用测序探针连接检测，连接反应体系中，模板与引物互补配对，引物连接在磁珠上，直接进行拍照。用银离子切除(银离子可以特异性的和硫元素结合，从而切断S-P键，断裂之后P接氢氧离子，S接上银离子)，如此所有通用碱基被切掉，5’端方向留下磷酸基团，下一个循环连接在5个碱基后面的位置。多次重复之后，去掉测序链重新杂交新的引物，新的引物比之前多一个碱基，再重新循环多次之后，去掉测序链杂交第3次的引物。这样重复多次可以使整个序列连接起来，并通过信号的交叉对比，确定每个位置的序列信息。

连接测序法有如下几方面的不足：(1)探针数量或种类多，导致成本较高；(2)SOLiD方法每次加入5个碱基，在一个循环或者几个循环之后要重新加载测序引物，增加测序成本和时间成本；(3)切除方法对测序体系并不友好。作为测序中的生化反应，很多酶对过渡金属非常敏感，另外，使用银离子容易有残留，难以避免对后续实验的影响，例如，反应的缓冲液中可能有氯离子，银离子易于与之生成沉淀；另外，银离子还可以和T碱基形成T-Ag-T结构的错误配对(mismatch)。

Illumina的边合成边测序方法则采用可逆阻断基团的修饰3’端羟基并且碱基上可逆连接荧光染料(如图1所示)，在每个循环聚合上一个碱基，检测该位置的荧光信号确定碱基信息，在确定碱基信息之后，对3’端阻断基团和碱基上的荧光染料进行切除，3’端阻断和碱基上连接荧光染料的基团为同一类型基团，因此可以被同时切除。

然而，Illumina的阻断采用叠氮亚甲基的方式，切除采用有机膦化物(如图2所示)，而染料和碱基之间有长链连接，长链中设计了叠氮亚甲基的衍生物。在切除之后连接基团和3’端一样也是有一个羟基生成，并且除了羟基之外还有数十个原子(如图3所示)。