[发明专利]用于序列数据标准化的新型内参寡核苷酸

说明书

本发明涉及特别地用于小RNA序列数据标准化的新型内参寡核苷酸。本发明特别地提供各自包括单链核酸分子的至少两个子集的多个集，每个核酸分子包括：5′磷酸、至少3个随机核苷酸的序列、至少8个核心核苷酸的含有与靶序列相比的至少一个错配的核心序列、至少3个随机核苷酸的序列、以及3′修饰，其中每个子集包括具有相同核心核苷酸序列和不同随机核苷酸的多个核酸分子，并且其中每个子集的核酸分子的区别在于核心核苷酸序列的至少一个核苷酸，及含有所述集的文库的生成。本发明还涉及核苷酸测序中的参考值和用于确定样本中靶序列量的方法。

技术领域

本发明涉及用于核苷酸序列数据的定量标准化的新型内参(spike-in)寡核苷酸。本发明提供包括至少两个子集的集，每个子集包括多个单链核酸分子，其中每个单链核酸分子包括5′磷酸、至少3个随机核苷酸的序列、与靶序列不互补的至少8个核苷酸的核心序列、至少3个随机核苷酸的序列、以及3′修饰。子集的核酸分子在核心核苷酸序列的至少一个核苷酸上不同。本发明还涉及产生含有集的文库，并涉及核苷酸测序中的参考值，以及涉及用于确定样本中靶序列的量的方法。

背景技术

下一代测序(next-generation sequencing，NGS)是一种大规模并行测序或深度测序技术，自2005年首次进入市场以来，已经对基因组研究产生了巨大影响。下一代技术已用于诸如基因组测序和重测序的标准测序应用，以及用于先前未由Sanger测序探索的新应用。所有NGS平台并行地对数百万个DNA小片段进行测序，并因此显著提高了有成本效益的序列通量，但却以牺牲读段长度为代价。

小RNA NGS文库构建以小RNA作为输入并产生相应的cDNA的文库。这导致短的核苷酸序列，即读段。为了推断原始样本中存在哪些RNA分子，将读段映射或比对到参考基因组或转录组上，或者基于序列重叠从头组装。生物信息学分析用于通过将各个读段映射到参考基因组来将这些片段拼接在一起。

来自高通量小RNA测序(sRNA-Seq)实验的数据通常被标准化并报告为相对值，例如读段数/百万基因组匹配的读段(RPM)¹。如果假设sRNA亚群在所分布的不同组织类型中具有相等的比例，则相对标准化效果良好。然而，这种假设通常是无效的，因为sRNA群在不同组织类型和各种突变体背景中经常是动态的^2-7。例如，基于miRNA定量中的相同起始材料，分析证明cDNA构建中的替代方法得到完全不同的miRNA表达水平谱³³。参与RNA末端修饰的酶是引起相对表达水平偏差的明显候选者，然而逆转录和PCR扩增的步骤也很可能显示出模板偏好，从而相比其他RNA有利于一些RNA的扩增。因此，比较相对标准化的sRNA-Seq值的标准实践可能产生误导结果。相比之下，sRNA-Seq数据的绝对标准化应能够在全基因组范围内准确比较不同细胞类型、突变组织或疾病状态中的小RNA水平。然而，先前使用外源sRNA寡核苷酸进行sRNA-Seq数据的绝对标准化的尝试具有不确定的成功率^8-10，因此并未广泛使用。Locati等人使用两组不同的分别由11个和19个寡核糖核苷酸组成的合成RNA内参，监测sRNA-seq中的尺寸选择并进行sRNA-seq的数据标准化(Locati et al.NucleicAcids Res.2015年8月18日；43(14))。特定sRNA内参的不同测序效率很可能是由于它们的固有特性，例如影响它们在sRNA-Seq文库构建过程中的连接效率的可变二级结构和RNA-接头共折叠^11-13。例如，先前需要额外的校正因子来扩展个体sRNA内参的量，以解释添加到样本中的外源sRNA内参的摩尔量与测序的相应读段数目之间的非线性关系¹⁰。

因此，虽然NGS是新基因发现和微调转录分析的有力工具，但当前的可用技术仍有一些问题尚未解决：