[发明专利]一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒。该方法包括：步骤a.根据核酸突变位点设计数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物对能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料；步骤b.对所述核酸位点进行数字PCR扩增和进行扩增后微液滴荧光检测，根据所述微液滴荧光信号差异来确定核酸突变顺反式结构。本发明利用ddPCR技术对模板的单分子分散能力，实现了对基因突变的顺反式结构进行特异性检测。

技术领域

本发明涉及数字PCR技术领域，具体涉及一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒。

背景技术

在基因突变中，当同一个基因的两个或多个突变位于相同等位基因上时为顺式突变，即两个或多个突变位于同一条染色体上；位于不同等位基因上时为反式突变，即两个或多个突变不都位于同染色体上。目前已有一些基因突变的顺反式结构被报道，而且其临床意义重要，不同的顺反式突变对临床治疗和用药指导具有不同的影响。例如，在肺癌靶向治疗中，使用奥希替尼后可能会发生耐药突变，其中表皮生长因子受体EGFR基因上的C797S突变已经明确为第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的耐药突变位点，而且临床前研究发现，如果EGFR T790M和C797S为反式突变，则对第一代和第三代EGFR TKI联合用药敏感，但如果为顺式突变，则对所有EGFR TKI耐药。因此，同一个基因的不同突变的顺反式结构对靶向治疗的敏感性可能有差异，检测基因突变的顺反式结构对于临床治疗及用药指导方面具有重要参考价值。随着精准医疗的到来，会有更多的顺反式突变被研究，并能够指导患者选择更佳的治疗方案。

随着数字PCR发展，基于微液滴的数字PCR技术(ddPCR)在突变检测中凸显出极大优势，该技术基于微流控芯片，可生成数微米到数百微米的液滴，液滴的体积通常为皮升到纳升级别，可以包裹单分子。微液滴是由惰性油相通过生物相容性的表面活性剂包裹水相而产生，常见的生物化学可以在微液滴中实现。该技术优势如下：(1)灵敏度高，一个液滴可包含单个分子或细胞，在物理层面实现单分子级检测；(2)绝对定量，每次微流体芯片可生成数百万个微液滴，对逐个微液滴统计，通过泊松分布计算模板数量，可实现数字化绝对定量，结论可靠。目前，基于微液滴技术的研究工作和各种应用领域已发表在Cell、Nature、Nature Biotechnology、PNAS等高水平杂志上。

发明内容

本发明利用ddPCR技术对模板的单分子分散能力，实现了对基因突变的顺反式结构进行特异性检测。

在一种方式中，本发明提供一种检测核酸突变顺反式结构的方法，所述方法包括：步骤a.根据核酸突变位点设计数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物对能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料；和步骤b.对所述核酸位点进行数字PCR扩增和进行扩增后微液滴荧光检测，根据所述微液滴荧光信号差异来确定核酸突变顺反式结构。

在一种实施方式中，本发明提供一种检测核酸突变顺反式结构的试剂盒，所述试剂盒包括：用于扩增包含核酸突变位点的数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料。

在一种实施方式中，所述核酸是DNA或RNA。

在一种实施方式中，当所述核酸是RNA时，所述方法还包括将所述RNA逆转录成cDNA的步骤。

在一种实施方式中，所述方法是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和C797S突变顺反式结构的方法。