[发明专利]一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种检测核酸突变顺反式结构的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤a.根据核酸突变位点设计数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物对能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料；

步骤b.对所述核酸位点进行数字PCR扩增和进行扩增后微液滴荧光检测，根据所述微液滴荧光信号差异来确定核酸突变顺反式结构。

2.权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述核酸是DNA或RNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述核酸是RNA时，所述方法还包括将所述RNA逆转录成cDNA的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和C797S突变顺反式结构的方法。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和L858R突变顺反式结构的方法。

6.一种检测核酸突变顺反式结构的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于扩增包含核酸突变位点的数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料。

7.权利要求6中所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸是DNA或RNA。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和C797S突变顺反式结构的试剂盒，所述试剂盒包括用于能够同时扩增EGFR基因T790M突变和C797S突变的数字PCR扩增的引物对SEQ ID NO：4:CACCTCCACCGTGCAGCT和SEQ ID NO：5:TCTTTGTGTTCCCGGACATAG；以及检测EGFR C797S基因型上两种突变的探针SEQID NO：1：TTCGGCAGCCTCC和SEQ ID NO：2：CTTCGGCTCCCTCCT，两种探针标记同一种荧光；和检测EGFR T790M突变型探针SEQ ID NO：3：ATGAGCTGCATGATGAG，该探针标记的荧光不同于检测EGFR C797S基因型上两种突变的探针标记的荧光。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和L858R突变顺反式结构的试剂盒，所述试剂盒包括用于能够同时扩增EGFR基因T790M突变和L858R突变的数字PCR扩增的引物对SEQ ID NO：4：CACCTCCACCGTGCAGCT和SEQ ID NO：6：CCTCCTTCTGCATGGTATTCT；以及检测检测EGFR T790M突变型探针SEQ ID NO：3：ATGAGCTGCATGATGAG，和检测L858R突变探针SEQ ID NO：7：AGTTTGGCCCGCCCAA，两探针标记不同的荧光。

10.根据权利要求6-9任一所述的检测核酸突变顺反式结构的试剂盒，其特征在于，各个引物在数字PCR扩增体系中的终浓度为200-800nM，各个探针在数字PCR扩增体系中的终浓度为100-600nM。