[发明专利]一种试剂盒、方法、引物对和探针及其应用

说明书

本发明公开了一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒，其包括实时荧光PCR反应体系，所述实时荧光PCR反应体系包括至少一种引物对及MGB探针。本发明还公开了一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的方法、引物对和探针及其应用。本发明所述试剂盒、引物对和探针应用于实时荧光PCR方法时具有简单快速、荧光本底信号弱、灵敏度更高，并且通过扩增曲线Ct值进行结果判定更加客观、重复性强的优点，特别能够区分猪及牛、羊等反刍类源性动物成分。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的方法，包括鉴别引物对及荧光探针。

背景技术

近年来，随着药典标准的提高，多种生化原料粗品需明确动物种属来源。2016年10月19日，国家食品药品监督管理总局发布《药品生产质量管理规范生化药品附录(征求意见稿)》，其中第四十条关于种属鉴别提到，生化药品的原材料来源应相对稳定，应明确动物的种属及器官组织。必要时对原材料的动物种属进行鉴别。此征求意见稿已于2017年09月01日起实施。此处的“动物”是指非人动物。目前动物来源的生化原料药物有100多种，主要来源是猪，其次是牛、羊、家禽等。

动物源性成分鉴别有物理学、化学、免疫学和分子生物学等方法。由于生产过程中的提取、纯化等工艺，不能用常规的理化方法来鉴别生化原料的种属来源，而分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)法具有快速、灵敏、特异性强的特点，已在肝素等生化药品或原料药的动物源性成分检测中有所应用。2014年FDA发布名为《多重荧光定量PCR检测原料药中反刍动物DNA用于监控肝素粗品质量》的指导原则，从肝素原料药中残留DNA的提取、纯化到反刍源性成分的实时荧光PCR检测各方面做了详细介绍。但鉴于肝素是一种多糖，指导原则中所述DNA提取方法不适用于蛋白类生化原料粗品，且指导原则所述方法仅可区分猪源性成分和反刍源性成分，而对于牛、羊等反刍源性成分无法进一步区分；另外，该实时荧光PCR检测试剂价格昂贵。专利申请CN 201710193080.0《鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对》中公开了一种常规PCR的检测方法，但是该方法检测过程繁琐，需通过电泳肉眼观测条带，结果判定受主观因素影响较大。

实时荧光定量PCR是一种常见的PCR技术，其主要是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的结果能够通过扩增曲线Ct值进行判定，更加客观，其与常规PCR相比，本身准确性和灵敏度就更高。其中，影响实时荧光定量PCR结果的关键之处在于所用引物对和探针的设计、以及引物对和探针之间的组成配合。如何设计出合适的引物和探针，所得结果的灵敏度与常规PCR方法相当或者更高，以及到底能够提高多少，这些都是不可预知的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有鉴别蛋白类生化原料粗品的检测方法检测过程繁琐、结果判定受主观因素影响较大、荧光本底信号强以及灵敏度不够高等缺陷，提供了一种一种试剂盒、方法、引物对和探针及其应用，特别是鉴别蛋白类生化原料粗品中动物、特别是偶蹄目动物源性成分的实时荧光PCR方法、试剂盒、引物对和探针。本发明所述试剂盒、引物对和探针应用于实时荧光PCR方法时具有简单快速、荧光本底信号弱、灵敏度更高，并且通过扩增曲线Ct值进行结果判定更加客观、重复性强的优点，特别能够区分猪及牛、羊等反刍类源性动物成分。

为了减弱荧光本底信号的强度，本发明人尝试采用实时荧光PCR来鉴别蛋白类生化原料粗品。本发明与专利申请CN201710193080.0均是针对相同靶基因设计的种属特异性引物，但专利申请CN201710193080.0中的引物和探针是针对基因序列的全长进行的设计，而实时荧光PCR要求扩增的片段长度在50-150bp，因此必须寻找一段长为100-200bp并且需要相对要保守的片段来设计引物与探针。猪和羊的靶向序列的同源性非常高，而越短的扩增片段引物的设计难度就越高。本发明人经过诸多试验和研究，终于寻找到合适的靶向片段，并且进行多种尝试之后，终于设计出能够达到优异效果的引物对和探针。