[发明专利]转基因玉米L239及其子代纯合体和杂合体的KASP检测引物

说明书

本发明提供用于检测转基因玉米L239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的KASP引物，引物序列如SEQ ID NO:1‑3所示。利用本发明提供的KASP引物，仅通过单个反应就能够鉴定出转基因玉米L239及其子代和衍生品系是转基因纯合体、杂合体或野生型。本方法检测通量远高于荧光定量PCR和普通PCR，具有准确率高、成本低、自动化程度高以及易于操作等优点。

技术领域

本发明属于分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及转基因玉米L239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的KASP检测引物及应用。

背景技术

相对于传统育种技术而言，转基因育种技术具有精准和高效的优势。通过遗传转化直接获得的转基因品系，往往由于综合农艺性状表现不佳，不能够直接应用于生产，需要通过回交的手段，将外源基因导入一个具有优良农艺性状背景的材料中，然后才能获得可用于生产的转基因品系。在回交育种中，需要对转基因植株中外源片段的纯合和杂合情况进行判定。目前主要方法有实时定量PCR、普通PCR以及Southern杂交。上述检测方法中，普通PCR需要电泳以及紫外观察的过程，操作繁琐，耗时长。Southern杂交的过程更加复杂，而且需要用到放射性元素。荧光定量PCR相对前两者流程简化了很多，但是如果染色体上有多个外源片段插入时，利用荧光定量PCR的方法进行检测，结果的准确度会受到影响。三种方法的自动化程度均不高，单位时间内能检测的样本数量有限，而且手动操作容易导致实验误差和实验污染。依靠上述常规的方法，很难实现对转基因作物进行高通量且低成本的纯合体和杂合体的有效区分。

转基因玉米L239是袁隆平农业高科技股份有限公司与北京大北农科技基团股份有限公司合作开发的一个对鳞翅目昆虫具有较好的抗性并对草甘膦除草剂具有较好的耐受性的转基因玉米自交系，而且农艺性状表现优良，产量与非转基因玉米自交系L239相当。因此，亟需开发一种高效且费用低廉的区分转基因玉米L239及其衍生品系纯合体和杂合体的方法。

竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。该技术现阶段主要被应用于SNP或InDel基因分型研究中，正逐渐成为分子辅助育种、性状基因的精细定位，以及种子资源鉴定的主要技术手段。目前尚未见到利用KASP技术区分转基因玉米L239及其衍生品系纯合体和杂合体的引物及检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供转基因玉米L239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的KASP检测引物及应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供转基因玉米L239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的KASP检测引物，所述引物包括(SEQ ID NO:1-3)：

引物F:5’-TAGTACGAAAGCGACCCCACC-3’

引物H:5’-CCAACACCGTGAGGCTAGTG-3’

引物C:5’-GCAAATAGGAAACAGGAAAGGAGAC-3’

第二方面，本发明提供含有所述引物F、H和C的检测试剂或试剂盒。

第三方面，本发明提供所述引物F、H和C，或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴定或筛选对鳞翅目昆虫具有较好抗性且对草甘膦除草剂具有较好耐受性的转基因玉米L239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体中的应用。

进一步地，本发明提供一种用于鉴定对鳞翅目昆虫具有较好抗性且对草甘膦除草剂具有较好耐受性的转基因玉米L239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的方法，包括以下步骤：

1)提取待测玉米基因组DNA；

2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Mastermix，进行PCR扩增；