[发明专利]接头组合物及其应用

说明书

本发明提出了一种接头组合物。该接头组合物包括：第一接头；以及第二接头，其中，所述第一接头的3’末端序列与所述第二接头的5’末端序列在所述第一接头和第二接头自连时形成限制性内切酶识别位点。根据本发明实施例的接头组合物在自连时可以被限制性内切酶特异性切割和降解，进而将该接头组合物应用于文库构建时，自连的接头在限制性内切酶的作用下无法进入下游实验，有效提高了测序数据的利用率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及接头组合物及其应用，更具体地，本发明涉及接头组合物、构建测序文库的方法、核酸分子、测序文库、测序方法以及确定RNA序列信息的方法。

背景技术

小RNA(Small RNA)是生物体内一类重要的功能分子，通过各种序列特异性的基因沉默作用，调控诸如细胞生长发育、应激反应、沉默转座子等细胞生理过程。

Small RNA测序则是借助新一代高通量测序技术，对某物种某组织在特定状态下的18-30nt的small RNA进行的高通量测序。继而通过数据库比对，对获得的small RNA序列进行分析、鉴定，将数百万条small RNA序列分类成rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和miRNA等。

现有的Small RNA文库构建流程包括下述步骤：电泳分离总RNA，并回收18-30nt的组分；在small RNA两端依次连接3’接头和5’接头；连接产物进行反转录和PCR扩增，得到small RNA文库。然而在Small RNA文库构建流程的接头连接过程中，会产生大量接头自连产物(adapter dimers)。接头自连的产生，会极大浪费测序数据，甚至有可能带来下游步骤扩增效率的偏向，影响测序及分析结果的准确性。

因此，如何有效降低接头自连的产生或降低接头自连带来的不利影响，是提高SmallRNA测序及分析准确性的关键问题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明建立了一种可实践地、高效率地减少small RNA文库接头自连产生的方法。该方法通过仅修改接头序列并引入以cDNA为底物的限制性内切酶，特异性的降解接头自连产物，从而避免接头自连产物进入下游实验，确保了测序数据的高利用率。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种接头组合物。根据本发明的实施例，所述接头组合物包括：第一接头；以及第二接头，其中，所述第一接头的3’末端序列与所述第二接头的5’末端序列在所述第一接头和第二接头自连时形成限制性内切酶识别位点。根据本发明实施例的接头组合物在自连时可以被限制性内切酶特异性切割和降解，进而将根据本发明实施例的接头组合物应用于文库构建时，自连的接头在限制性内切酶的作用下无法进入下游实验，相较于现有技术，测序数据的利用率显著提高。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将RNA样本与前面所述的接头组合物进行连接，以便获得连接产物；(2)将所述连接产物进行反转录处理，以便获得反转录产物；(3)将所述反转录产物进行酶切处理以便获得酶切处理产物，所述酶切处理是在限制性内切酶的作用下进行的，所述限制性内切酶特异性识别所述限制性内切酶识别位点；(4)将所述酶切处理产物进行扩增反应，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。根据本发明实施例的方法，在接头中引入以cDNA为底物的限制性内切酶识别位点，当发生接头自连时，限制性内切酶能够特异性切割和降解接头自连产物，接头自连产物被切割和降解后，由于缺乏完整的5’和3’端与PCR引物退火的位点，接头自连产物无法进入后续的PCR扩增，进而有效避免了接头自连产物进入下游实验，所获得的RNA测序文库用于RNA测序和数据分析，数据利用率高和分析结果准确度高。