[发明专利]用于检测糖尿病风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测糖尿病风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法。本发明的核酸序列组合是针对糖尿病5个多态性位点(rs228648，rs114202595，rs7754840，rs7756992和rs7574865)提出的，包括每个位点野生型的上游引物、突变型的上游引物和通用下游引物，应用该核酸序列组合制备的快速检测糖尿病风险位点的试剂盒，使用方便，操作简便，自动化程度高，减少了在操作过程的污染，检测效果好，具有高灵敏度，高特异性，高准确度，高精确度的特点。本发明的检测方法采用完全闭管操作，方便快捷、通过直接探索PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性的技术问题，能有效避免出现非特异性扩增，适合大批量样本检测。

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种用于检测糖尿病风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法。

背景技术

糖尿病是一种由遗传因素及环境因素共同参与相互作用的多基因病，1型或2型糖尿病均存在明显的遗传异质性。1型糖尿病(T1DM)是一种免疫调节性疾病，是由免疫失调产生炎症细胞因子，诱发胰岛产生炎症引起的。2型糖尿病(T2DM)是由于胰岛素抵抗和β细胞分泌缺陷导致高血糖的一种复杂多基因疾病，糖尿病患者中90％以上为2型糖尿病。

UST2(rs228648)与G蛋白偶联受体GPR14结合后影响细胞内Ca²⁺内流，进而影响胰岛素分泌障碍，故T2DM患者的血清UTS2显著高于正常人，另一方面UTS2还可抑制胰岛素的释放，使人群的胰岛素抵抗程度加深，UST2rs228648位点多态性使UTS2浓度变化，引起胰岛素抵抗，在T2DM的发生中起重要作用。

转录因子配对盒4(PAX4)主要功能为胰腺发育的转录抑制因子，在胰腺B细胞的分化和发育过程中发挥重要作用，PAX4基因敲除小鼠胰腺成熟的胰岛素分泌细胞和生长抑制分泌细胞完全增生，而分泌胰高血糖素的B细胞增生。日本人研究结果提示rs114202595多态性与日本人群T2DM相关，且对胰岛B细胞的功能有影响。另一报道显示，携带rs114202595AA型的T2DM患者缺乏胰岛素分泌第一时相，可见PAX4作为T2DM的发病发展中的重要基因，其突变可对T2DM的发病产生影响。

CDK5调节亚单位相关蛋白1类似物1(CDKAL1)在保护β细胞功能、降低血糖方面发挥重要的作用，若CDKAL1基因发生变异，则对CDK5失去抑制作用，影响胰岛β细胞的分泌功能，使胰岛素的分泌减少，导致T2DM的发生。据研究表明，rs7756992位点和rs7754840位点多态性在许多东亚人群中与T2DM的发病显著相关，因此对CDKAL1的两种SNP位点检测有助于分析人群中糖尿病风险分析。

信号转导和转录活化因子(STAT4)参与JAK/STAT信号途径，在Th1/Th2的分化调控及因此失调引发的各种自身免疫性疾病如1型糖尿病(T1DM)中发挥重要作用，在研究南方汉族人群中，STAT4rs7574865位点多态性与T1DM的发病强相关，因此STAT4位点多态性在T1DM中有重要作用。

目前，检测基因多态性和基因突变的方法主要有sanger测序法、基因芯片杂交法、PCR-RFLP法和荧光定量PCR法。Sanger测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但仪器昂贵，灵敏度低，操作复杂，周期长，容易污染；普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，存在由PCR产物污染导致假阳性的风险；基因芯片技术具有高通量，微型化，自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵，这些缺点限制了这三种方法在实际临床工作中的发展和应用，无法满足快速指导临床评估要求。因此，一种快速、准确且低成本的新型检测方法成为了临床检查的迫切需求。

发明内容