[发明专利]一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域。本发明将针对突变型基因所设计的反向引物和其相对应野生型基因所设计的反向引物分别相邻地固定于固相介质表面。本发明将等温重组酶聚合酶扩增技术(RPA)与固相微阵列相结合，可同时在硝酸纤维膜上进行多个基因单点突变的筛查，也可置于96孔平底微盘进行自动高通量筛选基因突变。采用本发明进行核酸突变检测，整个反应可以在30分钟内完成，无需加热循环仪，操作简易，检测效率高，可直接基于固相介质上的呈色反应判读检测结果。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法。

背景技术

目前在基因突变检测领域，有几种方法可以用来检测基因的点突变，这些方法的敏感性、反应时间、以及费用各不相同。传统突变检测方法为杂交和DNA测序，而这些方法步骤复杂且消耗时间。多聚酶链式反应(PCR)技术的出现为该领域的发展提供了新的线索。目前的突变检测方法几乎无一例外的是基于PCR技术，包括基于PCR的测序、高分辨熔解分析(HRMA)、探针扩增阻滞突变系统(ARMS)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)。在这些方法中，DNA测序，又称为Sanger测序或双脱氧测序，被认为是金标准，缘于该方法沿着每个核苷酸检测DNA序列因此能够鉴定出检测基因片段中的所有可能突变，包括碱基置换、插入或者缺失。然而该方法敏感性低，仅为20％，且耗费劳力和时间。该测序法的一个替代方法如焦磷酸测序，其敏感性已被证明可达5％-10％。在非测序方法中，ARMS、HRMA、PCR-RFLP，还有等位基因特异性实时定量PCR，都是基于实时定量PCR技术。这些技术在过去几年中已被Sanger测序法作为参考研究印证，证实了在基因突变检测中的有效性可可行性。

HRMA，通常基于实时定量PCR，是通过在熔解的DNA双链中插入染料的方法检测其变化，以确定突变。该方法快速敏感但已被报道有20％的假阳性。所以，该方法需要测序验证，且不能显示确实的突变方式。等位基因特异性实时定量PCR以及ARMS仅能检测靶基因有限的突变位点，使得这些方法在临床实践中不怎么切实可行。最近，更敏感的方法已被应用于KRAS的检测。其中一种方法是PCR钳分析技术，另一种方法是co-amplification atlower denaturation temperature低变性温度共扩增PCR(COLD-PCR)。PCR钳分析利用突变特异性杂交探针以及其它野生型互补多肽核酸探针，以抑制正常序列的扩增，能够检测小于1％的等位基因。COLD-PCR是另外一种选择性扩增系统，能够从混合DNA序列中富集微量等位基因。该方法是基于与野生型比较突变同源双链有着较低的熔解温度。因此，在COLD-PCR，变性温度设定在80℃，而在常规PCR变形温度将近94℃。作为一个敏感的DNA富集方法，COLD-PCR通常跟随着HRMA和焦磷酸测序。突变分离聚合酶链反应(MS-PCR)是一种新的基于PCR的检测方法，可以在核酸序列中鉴别已知的等位基因突变。该方法的基本原则是，使用带有突变位置离3‘端不同距离的等位基因引物，以等位基因依赖的方式，将突变引入PCR引物在扩增DNA的结合区。在接下来的循环中，由于错误引物不稳定的延伸，突变可以防止扩增产物的形成。MS-PCR过程中形成的产物对于它们各自的等位基因是特异的，并且能被凝胶电泳直接鉴别。

由此可见目前，基于多聚酶链式反应(PCR)的方法为突变检测的主流方法，但是这些方法耗费时间且价格昂贵。一个可能的替代是等温核酸扩增技术，该方法在整个反应过程中使用单一温度，运用不同的机制如某些多聚酶的链替代活性或者加入在自然修复过程中使用的蛋白。等温核酸扩增技术中的例子是环介导的扩增(LAMP)、螺旋酶依赖的扩增(HAD)、链替代扩增(SDA)以及滚环扩增(RCA)，这些方法最近已有叙述并且已证明了其应用价值。另一个有希望的方法是重组酶多聚酶反应(RPA)，该方法使用一种噬菌体重组酶以引导短寡核苷酸引物到同源靶序列上。与一种链置换多聚酶以及一种单链DNA结合蛋白结合使用，扩增少于10个拷贝的基因组DNA可以在少于30分钟内完成。并且，反应的运行仅需要持续37–39℃低温，以及仅需2个引物的PCR养系统，后者提供了多重检测的可能性。

发明内容