[发明专利]基于宫颈癌宿主细胞的甲基化检测方法

说明书

本发明公开了基于宫颈癌宿主细胞的甲基化检测方法。在宫颈癌早筛中，宫颈脱落细胞采样量低时，提取的DNA量会出现低于100ng，甚至低于10ng的情况，达不到甲基化建库测序要求，使得难以快速再次获得的宫颈脱落细胞遭到浪费，且大大降低早筛效率。本发明方法能满足宫颈脱落细胞采样量低的要求，对DNA起始量为10ng的样本也可实现甲基化测序，并且检测准确率高，避免了低样本量的宫颈癌宿主细胞浪费。本发明方法在接头连接反应液、PCR扩增酶的优选、CT Conversion Reagent溶液处理时间上进行了创造性改进，实现了10ng灵敏度的微量甲基化建库测序。

技术领域

本发明属于高通量测序领域，更具体地，涉及基于宫颈癌宿主细胞的甲基化检测方法。

背景技术

宫颈癌是严重威胁女性健康的世界性恶性肿瘤。宫颈原位癌一般高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，但近年来发现宫颈癌发病年龄呈年轻化趋势。全球每年死于宫颈癌的女性有20多万例，其中85％发生在发展中国家。据统计，中国的宫颈癌发病率已居世界第二，成为中国女性的杀手之一，摧残数以万计的女性的健康，影响中国千万家庭的幸福生活。因此，如果能寻找出能够有效早期筛查宫颈癌前病变的检测方法，就可以在病变早期进行干预治疗，从而降低我国女性宫颈癌死亡率。

此前，宫颈癌早筛以液基薄层脱落细胞学检查(TCT)为主，但受取材及标本制作过程的影响，该法仍存在一定的假阳性率及假阴性率；此外，TCT检查缺乏组织结构，并不能作为最终的诊断依据。甲基化为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。正常人DNA序列中有很多富含CpG的区域，被称为CpG岛，通常这些区域是非甲基化的，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的，这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失，从而导致细胞的增殖失控形成恶性肿瘤细胞。因此，甲基化检测可用于癌症早期的辅助检测。

目前有关DNA异常甲基化对宫颈癌作用的研究取得了巨大出的进步，但现有的基于宫颈癌宿主细胞的甲基化检测方法主要为单个或者多个位点的标志物检测，其具有检测位点少，诊断准确率不高的缺陷，因此，采用高通量测序检测甲基化可以克服以上缺点。此外，宫颈癌宿主细胞的采样量与DNA提取量直接相关，从而决定了检测的成败，宫颈脱落细胞采样不可避免的出现采样量低的情况，从而导致无法进行甲基化检测。引起采样量低的原因主要是：1、由于操作人员采集操作不规范；2、受检者对采样的认知程度较低(经期间不可采集、检查前24～48h内避免性生活、盆浴、以及阴道冲洗和用药)；3、受检者炎症细胞太多(阴道炎)，导致取样量少；4、取材时会导致宫颈出血，无法进一步采样5、采样会带有分泌物，取到的白细胞和脓细胞较多，而宫颈脱落细胞较少。针对这些问题重新采样一方面延长了筛查时间(生理要求三个月后才能重新采样)，另一方面是有些受检者即使重采样仍然无法获得合格的采样量。因此，为了克服以上缺陷，针对采样量低的宫颈癌宿主细胞的甲基化检测，是提高早筛效率的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种宫颈癌宿主细胞的甲基化测序方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种宫颈脱落细胞DNA的甲基化测序方法，包括如下步骤：

(1)提取宫颈脱落细胞的基因组DNA；

(2)将步骤(1)提取的DNA进行片段化、末端修复和3’端加A；

(3)将步骤(2)的产物与甲基化接头、T4连接酶和连接反应液反应，获得加接头的DNA片段，进行纯化；

(4)将步骤(3)的产物进行重亚硫酸盐处理并纯化，将DNA片段中未甲基化的C转化为U；

(5)将步骤(4)的产物进行PCR扩增、纯化，获得测序文库；