[发明专利]基于宫颈癌宿主细胞的甲基化检测方法在审
| 申请号： | 201711361831.1 | 申请日： | 2017-12-18 |
| 公开（公告）号： | CN108103193A | 公开（公告）日： | 2018-06-01 |
| 发明（设计）人： | 糜庆丰;夏渝东;张小安;崔世红;刘海量;吴春求;程国梅;任琛琛;黑娜;刘丽菲 | 申请（专利权）人： | 东莞博奥木华基因科技有限公司;郑州大学第三附属医院(河南省妇幼保健院) |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12Q1/6806;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 523808 广东省东莞市松山湖高新技*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 宫颈癌 宫颈脱落细胞 宿主细胞 甲基化检测 采样量 甲基化 测序 建库 甲基化测序 接头连接 溶液处理 灵敏度 起始量 样本量 准确率 优选 样本 检测 改进 | ||
1.一种宫颈脱落细胞DNA的甲基化测序方法，包括如下步骤：
(1)提取宫颈脱落细胞的基因组DNA；
(2)将步骤(1)提取的DNA进行片段化、末端修复和3’端加A；
(3)将步骤(2)的产物与甲基化接头、T4连接酶和连接反应液反应，获得加接头的DNA片段，进行纯化；
(4)将步骤(3)的产物进行重亚硫酸盐处理并纯化，将DNA片段中未甲基化的C转化为U；
(5)将步骤(4)的产物进行PCR扩增、纯化，获得测序文库；
(6)将测序文库进行高通量测序，获得的测序数据进行生物信息学分析甲基化情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法用于10ng及以上的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法用于10ng～25ng的基因组DNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，连接反应液在反应体系中含有如下组分：Tris-HCl 50～100mM、MgCl
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，重亚硫酸盐处理并纯化采用EZDNA Methylation-Lighting
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重亚硫酸盐处理是采用CTConversion Reagent溶液对DNA片段进行处理，处理条件为95～98℃反应7～9min，53～55℃反应45～60min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，PCR扩增采用KAPA HiFiHotStart Uracil+ReadyMix PCR Kit作为酶反应试剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纯化采用磁珠纯化法。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)和/或步骤(5)后还可以进行DNA定量。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：高通量测序采用illumina测序平台。
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