[发明专利]一种荧光定量PCR技术防治肺结核的方法

说明书

一种荧光定量PCR技术防治肺结核的方法，反应体系（40μl）：4.0μl10×buffer，7.0mmol/LMg2+，200μmol/L dNTP，0.2μmol/L上下游引物，0.2μmol/L探针，4μlLDNA模板，2.5U Taq DNA聚合酶。94℃ 3min，94℃ 20s，52℃ 20s，72℃ 20s，40次循环。按照荧光定量PCR分析软件设定基线（baseline）与阈值（threshold），以结核分枝杆菌H37Ra为参考菌株，PCR扩增IS6110基因并克隆到质粒载体。提取纯化重组DNA，10倍系列准确定量稀释102～107Copies/ml的DNA模板，分别取4μl进行荧光定量PCR扩增。呈对数增长，Ct值≤36即可判定为阳性；如扩增曲线不规则或Ct值＞40，报告为阴性。

技术领域

本发明涉及一种荧光定量PCR技术防治肺结核的方法，具体地说是以一种荧光定量PCR技术防治肺结核的方法。

背景技术

目前公知的目前结核病仍是全球性的重大公共卫生问题之一。全球现有肺结核病人2000多万，其中95％在发展中国家，我国是22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核患者居世界第二位，每年因结核病死亡的人数达到15万人，给国家和社会带来沉重负担，严重影响我国经济和社会的发展。

发明内容

材料与方法；疑似病人，采集2015～2016年5月到深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者的痰液标本168份，其中男性115份，女性53份，年龄15～60岁。确诊患者，选择临床确诊肺结核病人，有低热、乏力、食欲不振、咳嗽和少量咯血等典型肺结核表现，X线健康检查肺部有结核病灶，实验室检测结果为阳性。为确保样本采集的连贯性，在争取病人同意随访的同时，选择暂时在家休养的就近病人。跟踪随访采集深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者漱口后痰液，选取3例活动性肺结核患者，采集病人服药前1天的晨痰，随访中1～7日内每天采集1次，后续间隔2～5天采集1次。仪器 Bact/Alert 3D全自动细菌快速培养和药敏检测系统、Heraeus低温冷冻离心机Megafuge 1.0R、Biospec-mini DNA/RNA/Proteinanalyzer（岛津）、7500荧光定量PCR扩增仪（Applied Biosystems）、凝胶成像系统（英国UVItec）。抗酸染色法与集菌培养法 操作参考《结核病诊断细菌学检验规程》进行。痰液DNA的提取 取0.5ml痰标本加入2倍样本体积4％的NaOH，液化10min后15000r/min离心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml灭菌水，充分振荡混匀，15 000r/min离心2min，去上清液，重复洗涤3次；沉淀中加入50μl DNA提取液（1％NP-40 + 2％Triton X-100），充分振荡混匀，100℃水浴10min；待冷却至室温，15 000r/min离心5min，取上清液备用。