[发明专利]一种引物组合物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种引物组合物及其应用。

背景技术

DNA甲基化转移酶1(DNA methyl transferase 1，DNMT1)是细胞内DNA进行复制修复，并维持正常甲基化的关键酶。DNMT1的主要功能是保持细胞内某些蛋白质或核酸甲基化状态，具体以活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)为甲基供体，将甲基转移到特定的分子上。甲基化修饰与细胞内多种过程相关，包括基因表达的调控、蛋白质功能的调节、核糖核酸加工以及重金属修饰等。DNMT1在结构上包含三个区域，即C端的催化区、N端的靶区域以及功能未知区域。研究表明，DNMT1的异常表达可能是导致体内甲基化状态改变的重要原因，并与衰老、老年痴呆及多种肿瘤等疾病的形成密切相关。当前，靶向抑制DNMT1基因的表达已经成为新药研究的热点。

研究调节基因表达方法，特别是抑制基因表达的一种重要技术方法是构建shRNA载体，并使其在细胞中表达，从而通过RNA干扰机制沉默基因的表达。shRNA(short hairpin RNA)即“短发夹RNA”，包括两个短反向重复序列，中间由茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。shRNA载体构建是通过设计目的基因shRNA序列，并克隆至特定载体中；经过转染细胞后转录生成shRNA，利用细胞内Dicer酶生成小片段干扰RNA，并最终靶向目的基因mRNA，从而达到基因沉默的效果。

CN103757021A公开了一种沉默DNMT基因的双链siRNA分子及其应用，针对人肿瘤细胞DNMT基因的核苷酸序列设计合成siRNA，所述siRNA转入肝癌细胞后能明显促进免疫原性相关蛋白的表达。该发明的siRNA分子可以应用于制备调节细胞中DNMT基因的药物中发挥RNA干扰的作用，增强免疫细胞的毒性反应，诱导肿瘤细胞消退，达到治疗肿瘤的目的。

CN105132413A公开一种用于制备shRNA的引物及制备方法、载体及构建方法，用于制备shRNA的引物包括引物P1、P2、P3；P1长度为34nt，从5’端开始，依次为突出的粘性末端ACCG，21nt的siRNA正向序列，loop序列，以及与siRNA正向序列3’末端3个碱基反向互补的碱基；P2的5’端4个碱基由ACCG改变为AAAA，其余序列与P1相同；P3是siRNA正向序列5’末端18nt序列的反向互补序列。

目前构建shRNA载体的首要步骤是根据目的基因设计两条寡聚核苷酸(oligo)，每条寡聚核苷酸都包含：正向引物-茎环-反义链的结构，正向引物和反义链是两个反向重复序列，长度通常为21bp，而茎环结构通常长度为6bp，再加上两点设计的粘性末端，因此每一条寡聚核苷酸长度通常在55bp以上。基于当前的设计方法，从合成角度看，长的核苷酸链会增加合成难度，更容易产生突变，不利于研究工作的开展甚至导致基因沉默的效果不佳；而从经济的角度看，越长的核苷酸链合成价格更高，增加了研究工作的经济成本。

因此，研究一种更为高效的构建shDNMT1载体的方法，即引物组合物的设计方法，降低合成的难度和成本，减少合成引物的突变，有效抑制DNMT1的表达，将shDNMT1作为基因治疗手段，研究shDNMT1在肺癌等肿瘤疾病的基因治疗方面的应用，具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种引物组合物及其应用，本发明将shRNA载体构建过程中根据目的基因设计的两条寡聚核苷酸引物拆分成三条，缩短了引物长度，降低了合成难度和成本，不容易产生突变，提高了shRNA载体的准确性。由所述引物组合物制备得到的shRNA、包含该shRNA的慢病毒载体和药物能够抑制目的基因的表达，用于癌症的治疗和药物的研发。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种引物组合物，所述引物组合物包括P1、P2和P3，所述P1包括粘性末端1、正向引物和茎环序列，所述P2包括粘性末端2、反向引物和所述P1的茎环序列的反向互补序列，P3为正向引物的反向互补序列，其中，所述正向引物为目的基因的siRNA对应的靶位点序列，所述正向引物和所述反向引物互为互补链。

发明人在长期的shRNA实验过程中，出于缩短引物长度以减少突变和降低成本的动机，反复摸索实验条件和步骤，创造性地将shRNA载体构建过程中惯用的引物设计原则进行更改，把两条引物拆分成三条，经实践后证明真实有效，能够显著抑制基因的表达。

优选地，所述正向引物的目的基因包括，优选为DNMT1。