[发明专利]基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用，该试剂盒包括检测VIM、BCL2、PODLX和TGFB1基因的上下游引物及探针，还包括检测B2M内参基因的上下游引物及探针。本发明荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于慢性肾脏病多种相关发病基因的快速检测。同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测慢性肾脏病相关基因的mRNA表达水平。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用。

背景技术

慢性肾脏病(CKD)是由各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，包括肾脏病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常，或肾小球滤过率(GFR)下降(<60ml/min·1.73m2)超过3个月。肾脏纤维化是慢性肾脏病(CKD)进展为终末期肾病(ESKD)的关键病理改变，其特征为肾脏固有细胞受损、丢失，并出现大量胶原沉积和积聚。肾功能指标(如血清肌酐等)、尿蛋白定量以及肾穿刺活检是目前临床上最常用的慢性肾脏病及肾脏纤维化诊断方法。然而由于肾脏有较强的代偿能力，肾功能指标不能反映早期纤维化及其严重程度。尿蛋白检测受诸多因素影响，且主要反映肾小球损害，不能反映肾脏间质纤维化程度。而肾活检为创伤性检查，可引起出血等并发症，不宜用于早期筛查及长期监测。信使核糖核酸(mRNA)由DNA的一条链作为模板转录而来的、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。已有大量研究证明在慢性肾脏病发生发展过程中，肾脏固有细胞内众多mRNA表达水平改变。研究表明，VIM、BCL2、PODLX以及TGFB1基因在慢性肾脏病发生发展过程中起重要作用，检测相应mRNA水平对慢性肾脏病的分子病理分型及预后监测具有独特价值。

基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过Taqman探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性率低，特异性好。

发明目的

发明内容：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒。该荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于慢性肾脏病相关发病基因的快速检测。

本发明还提供该基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR试剂盒的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，包括检测VIM基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-3所示；检测BCL2基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO 4-6所示；检测PODLX基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 7-9所示；检测TGFB1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 10-12所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 13-15所示。

其中，所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。

所述PCR酶混合液为m-mlv逆转录酶和RNase inhibitor混合液。

所述MasterMix包含浓度为75mM～125mM的KCl，浓度为4mM～8mM的MgCl₂，浓度为20mM～100mM、pH为7.9～8.3的Tris-HCl，浓度为0.2uM～0.8uM的dNTPs，浓度为0.02U～0.1U/ul的热启动Taq酶，0.125×到1×之间的SYBR Green I，以及适量的PCR增强剂。

其中，所述VIM、BCL2、PODLX、TGFB1和B2M基因的探针连接的荧光基团为：FAM-BHQ1。