[发明专利]一种基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒及其用途

说明书

技术领域

本发明属于疾病疗效评价领域，特别涉及一种基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒及其用途。

背景技术

肺结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性肺部感染性疾病，严重威胁人类健康，在中国的流行形势十分严峻。目前我国尚无明确的肺结核病疗效评价指标，导致14％的出院患者尚未完全治愈；也导致另一部分患者过度治疗，造成药物毒副反应增加，经济负担加重，医药资源浪费等。

目前，对肺结核病的疗效评价主要通过临床医生的经验判断和痰培养实验。然而通过胸部X片/CT影像学改变等经验判断主观性太强，容易误诊；痰培养检查又耗时太长，需要4-8周，分辨功效差，特异性仅为57.8％。因此，亟需建立一种敏感、高效、准确的肺结核疗效评价新判定方法。miRNAs不易在血液中被酶降解，且具有组织和细胞特异性，能够用于疾病分子诊断和预后预测，适合作为疾病的候选检测标志物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒及其用途，该试剂盒可以高效、准确的评价肺结核病患者的治疗效果，特异性强、敏感性高。

基于上述目的，本发明提供的一种基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒，包括RNA提取缓冲液，加Poly(A)反应液，逆转录反应液，血清miRNA上游引物组合、内参上游引物、通用下游引物以及荧光定量RT-PCR反应液；

其中，所述血清miRNA组合物由4个差异表达的血清miRNAs组成，这4个血清miRNAs的名称和序列分别如下所示：

hsa-miR-21-5p：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，其为SEQ ID NO:1序列；

hsa-miR-92a-3p：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU，其为SEQ ID NO:2序列；

hsa-miR-125a-5p：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA，其为SEQ ID NO:3序列；

hsa-miR-148b-3p：UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU，其为SEQ ID NO:4序列；

所述内参为hsa-miR-16，序列为：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG，其为SEQ ID NO:5序列。

本发明筛选出4个血清miRNAs作为肺结核治疗效果判定的生物标志物，该4个血清miRNAs在未用药、治疗2个月、治愈肺结核病患者、健康对照者血清均有显著性差异表达，可以作为肺结核治疗效果判定的分子标志物；同时为了避免由于不同患者的个体差异，仅用1-2个miRNAs去判定肺结核治疗效果显得极为不可靠的问题，本发明筛选出一组miRNAs，建立miRNAs表达谱模型可使结果更加可靠。本发明应用Solexa测序技术筛选血清中差异表达的特异miRNAs，作为肺结核治疗效果判定的生物标志物，是一种特异性强、敏感性高的肺结核治疗效果评价方法，对肺结核治疗效果的评价具有重要的意义。

在本发明的一些实施例中，所述RNA提取缓冲液包括：BIOZOL、氯仿、无水乙醇、浓度为75％的乙醇溶液和RNAase-free水；

所述加Poly(A)反应液包括：总RNA、5U/μL的大肠杆菌Poly(A)聚合酶、10×Poly(A)聚合酶缓冲液、5×rATP溶液和RNase-Free水；

所述逆转录反应液包括：Poly(A)反应液、10×通用逆转录引物、10×通用逆转录引物缓冲液、2.5mM的dNTPs、40U/μL的RNase抑制剂、反转录酶和RNase-Free水；

所述血清miRNA上游引物组合由hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物和hsa-miR-148b-3p的上游引物组成；

所述荧光定量RT-PCR反应液包括：2×miRcute miRNA预混物、目的上游引物、通用下游引物、50×ROX染液、cDNA模板和RNase-Free水；其中所述目的上游引物为hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物。