[发明专利]一种基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒及其用途

权利要求书

1.一种基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒，其特征在于，包括RNA提取缓冲液，加Poly(A)反应液，逆转录反应液，血清miRNA上游引物组合、内参上游引物、通用下游引物以及荧光定量RT-PCR反应液；

其中，所述血清miRNA组合物由4个差异表达的血清miRNAs组成，这4个血清miRNAs的名称和序列分别如下所示：

hsa-miR-21-5p：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，其为SEQ ID NO:1序列；

hsa-miR-92a-3p：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU，其为SEQ ID NO:2序列；

hsa-miR-125a-5p：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA，其为SEQ ID NO:3序列；

hsa-miR-148b-3p：UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU，其为SEQ ID NO:4序列；

所述内参为hsa-miR-16，序列为：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG，其为SEQ ID NO:5序列。

2.根据权利要求1所述的基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒，其特征在于，所述RNA提取缓冲液包括：BIOZOL、氯仿、无水乙醇、浓度为75％的乙醇溶液和RNAase-free水；

所述加Poly(A)反应液包括：总RNA、5U/μL的大肠杆菌Poly(A)聚合酶、10×Poly(A)聚合酶缓冲液、5×rATP溶液和RNase-Free水；

所述逆转录反应液包括：Poly(A)反应液、10×通用逆转录引物、10×通用逆转录引物缓冲液、2.5mM的dNTPs、40U/μL的RNase抑制剂、反转录酶和RNase-Free水；

所述血清miRNA上游引物组合由hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物和hsa-miR-148b-3p的上游引物组成；

所述荧光定量RT-PCR反应液包括：2×miRcute miRNA预混物、目的上游引物、通用下游引物、50×ROX染液、cDNA模板和RNase-Free水；其中所述目的上游引物为hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物。

3.根据权利要求1所述的基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒，其特征在于，加Poly(A)反应液体系以20.0μL计为：

总RNA：0.1～13.6μL；

5U/μL的大肠杆菌Poly(A)聚合酶：0.4μL；

10×Poly(A)聚合酶缓冲液：2.0μL；

5×rATP溶液：4.0μL；

RNase-Free水：补足至20.0μL；

其中，总RNA在该反应体系中浓度为2.0μg。

4.根据权利要求1所述的基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒，其特征在于，逆转录反应液体系以20.0μL计为：

Poly(A)反应液：2.0μL；

10×通用逆转录引物：2.0μL；

10×通用逆转录引物缓冲液：2.0μL；

2.5mM的dNTPs：1.0μL；

40U/μL的RNase抑制剂：1.0μL；

反转录酶：0.5μL；

RNase-Free水：11.5μL。

5.根据权利要求1所述的基于血清miRNA组合物的肺结核病疗效评价试剂盒，其特征在于，荧光定量RT-PCR反应液体系以20.0μL计为：

2×miRcute miRNA预混物：10.0μL；

10μM的目的上游引物：0.4μL；

10μM的通用下游引物：0.4μL；

50×ROX染液：1.6μL；

cDNA模板：2.0μL；

RNase-Free水：5.6μL；

其中所述目的上游引物为hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物。