[发明专利]一种检测人BRAF基因突变的探针法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人BRAF基因突变的探针法及检测试剂盒。该方法包括以下步骤：(1)在BRAF V600E PCR反应混合液中加入人类基因组DNA，形成BRAF V600E反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中BRAF V600E PCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的：BRAF V600E上游引物、BRAF V600E下游引物、BRAF V600E探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针；(2)结果判断：根据PCR扩增的突变Ct值进行分析。该试剂盒包括：BRAF V600E PCR反应混合液。该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的BRAF基因突变检测体系。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCR Taqman探针法及其检测试剂盒。

背景技术

BRAF基因是Ras的下游基因，属于RAF基因家族，与RAS基因一起调控RAS–RAF–MEK–ERK–MAP激酶通路，以介导细胞对生长信号的反应，而该通路在大部分肿瘤里面都会通过RAS和RAF家族成员被激活(David et al.，2006)。BRAF蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在肿瘤中常常发生点突变，突变后的BRAF蛋白激酶活性增高，引起细胞异常增殖分化。在约66％的恶性黑色素细胞瘤中发现BRAF的体细胞错义突变，在其它种类的肿瘤如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF突变(Helen etal.,2002)。所有的突变都集中在BRAF蛋白的激酶结构域，其中约80％的BRAF突变位于第1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的第600位氨基酸由谷氨酸变为缬氨酸(BRAF V600E)(Liang Wang，et al.，2013)。

本发明是基于荧光定量PCR平台开发出的检测方法，还结合了扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)。ARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说非常重要。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，设计2条ARMS上游引物，共用1条下游引物构成PCR反应体系。当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测野生型与突变型等位基因的目的。

发明内容

为了实现对人BRAF基因突变的检测，从而为肿瘤病理分型、预后判断提供参考，本发明提供了一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCR Taqman探针法及检测试剂盒，该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、步骤简单、灵敏度高、特异性强的BRAF基因突变检测体系。

一种检测人BRAF基因突变的实时荧光定量PCR Taqman探针法，包括以下步骤：

(1)在BRAF V600E PCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成BRAF V600E反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：

所述BRAF V600E PCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQ ID No.1所示序列的BRAF V600E上游引物、具有如序列表中SEQ ID No.2所示序列的BRAF V600E下游引物、具有如序列表中SEQ ID No.3所示序列的BRAF V600E探针、具有如序列表中SEQ ID No.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQ ID No.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQ ID No.6所示序列的内参探针；

(2)结果判断：根据人类基因组DNA在BRAF V600E反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。