[发明专利]一种催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制备和提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制备和提取方法，属生物技术领 域。

背景技术

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，可 促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。

1888年，GSH首先从酵母中分离出来，目前GSH的主要生产方法有：萃取法、生物发 酵法、化学合成法、化学-酶法。

萃取法：由于GSH在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和收率都不高，故在 实际生产中应用不广泛。

生物发酵法：存在着生产菌株中GSH含量较低，提取困难，成本造价高、产率不稳定 等问题。

化学合成法：比较复杂，反应步骤多、反应时间长、成本高、操作复杂、可能会发生 消旋而影响活性、环境污染等多种不利因素。

化学-酶法合成，即先用化学方法合成S-苄基甘氨酰半胱氨酸，再与谷氨酸在生物 催化酶谷氨酰转肽酶的作用下生成GSH：S-苄基-谷胱甘肽的产率受到酶纯度的严重影响， 而该酶的分离纯化工作量非常大，成本高。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的上述不足，为解决上述问题，本发明的第一 目的在于生产一种催化合成谷胱甘肽的生物酶。

本发明的第二个目的在于提供一种用于催化谷胱甘肽合成的生物酶的基因工程 菌株。

本发明的第三个目的在于提供一种编码所述催化合成谷胱甘肽的生物酶的核苷 酸序列。

本发明的第四个目的在于提供一种催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法。

本发明的第五个目的在于提供一种催化谷胱甘肽合成的生物酶的提取方法。

技术方案：一种催化谷胱甘肽合成的生物酶，所述生物酶为SEQIDNO:2所示的氨 基酸序列。

根据上述催化谷胱甘肽合成的生物酶，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工 程菌株；所述基因工程菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌；

一种编码权利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶核苷酸序列，所述核苷酸序列 如SEQIDNO:1所示。

一种如上述催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，包括如下步骤：

①构建谷胱甘肽生物合成酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切 重组到表达载体，转到宿主细胞中；

②选用具有氨苄青霉素抗性的质粒，作为基因载体，使构建的基因工程菌获得氨苄青 霉素抗性；

③挑选阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基活化培养；

④将③培养好的菌种转移至含氨苄青霉素的葡萄糖、铵盐培养基中，补加氨水，控制 pH培养至OD600达到28～32；

⑤将发酵体系温度缓慢降低至23～30℃，补加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG） 低温诱导；诱导培养过程中根据菌体生长情况补加葡萄糖溶液，维持体系稳定发酵；

⑥诱导培养14～17h，得到发酵液，即催化谷胱甘肽合成的生物酶。

作为优选，所述步骤①中构建基因工程菌表达载体的核苷酸序列；所述步骤②中 选用具有氨苄青霉素抗性的质粒作为基因载体；所述步骤①中选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 作为宿主细胞。

作为优选，所述步骤③、④中使用的培养基中添加了0.02～0.2mg/ml培养基的氨 苄青霉素。

作为优选，所述步骤④中培养温度35～38℃，溶氧25～45%，pH6.5～7.5；所述步骤 ⑤中诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷补加量为0.04～0.4mg/ml发酵液；所述步骤⑥ 中诱导过程中补加葡萄糖水溶液补加碳源，刺激生长；所述步骤④中诱导温度23～30℃，溶 氧20～40%，pH6.5～7.5；所述步骤②中磷酸盐缓冲液中有效成分含量：0.04416%NaH2PO4· H2O、0.60144%Na2HPO4·12H2O。

作为优选，所述步骤③中采用60～80MPa高压均质的方法进行细胞均质破碎两次； 所述步骤⑤中采用超滤的方法清除小分子杂质，浓缩酶液，提高有效成分含量；所述步骤⑥ 中采用物料体系温度控制0～4℃。

一种上述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的提取方法，包括如下步骤：

①将上述得到的发酵液离心分离收集菌体；