[发明专利]一种催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制备和提取方法

权利要求书

1.一种催化谷胱甘肽合成的生物酶，所述生物酶为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述催化谷胱甘肽合成的生物酶，其特征在于，所述生物酶来源于体 外重组构建的基因工程菌株；所述基因工程菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。

3.一种编码权利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶核苷酸序列，所述核苷酸序 列如SEQIDNO:1所示。

4.一种如权利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤：

①构建谷胱甘肽生物合成酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切 重组到表达载体，转到宿主细胞中；

②选用具有氨苄青霉素抗性的质粒，作为基因载体，使构建的基因工程菌获得氨苄青 霉素抗性；

③挑选阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基活化培养；

④将③培养好的菌种转移至含氨苄青霉素的葡萄糖、铵盐培养基中，补加氨水，控制 pH培养至OD600达到28～32；

⑤将发酵体系温度缓慢降低至23～30℃，补加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG） 低温诱导；

⑥诱导培养过程中根据菌体生长情况补加葡萄糖溶液，维持体系稳定发酵；

⑦诱导培养14～17h，得到发酵液，即催化谷胱甘肽合成的生物酶。

5.根据权利要求4所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，其特征在于，所述步 骤①中构建基因工程菌表达载体的核苷酸序列；所述步骤②中选用具有氨苄青霉素抗性的 质粒作为基因载体；所述步骤①中选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌作为宿主细胞。

6.根据权利要求4所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，其特征在于，所述步 骤③、④中使用的培养基中添加了0.02～0.2mg/ml培养基的氨苄青霉素。

7.根据权利要求4所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，其特征在于，所述步 骤④中使用20～30%的工业氨水，控制发酵体系pH稳定在6.5～7.5；培养温度35～38℃，溶 氧25～45%，pH6.5～7.5；所述步骤⑤中诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷补加量为 0.04～0.4mg/ml；所述步骤④中诱导温度23～30℃，溶氧20～40%，pH6.5～7.5；所述步骤② 中磷酸盐缓冲液中有效成分含量：0.04416%NaH2PO4·H2O、0.60144%Na2HPO4·12H2O。

8.根据权利要求4所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶制备方法，其特征在于，所述步骤 ③中采用60～80MPa高压均质的方法进行细胞均质破碎至少两次；所述步骤⑤中采用超滤 的方法清除小分子杂质，浓缩酶液，提高有效成分含量；所述步骤⑥中采用物料体系温度控 制0～4℃。

9.一种权利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的提取方法，其特征在于，包括如 下步骤：

①将上述发酵液离心收集菌泥；

②配制菌泥三倍质量的磷酸盐缓冲液与菌泥混合均匀；

③菌泥、磷酸盐缓冲液混合均质破碎；

④离心固液分离，将不溶性细胞残渣分离，收集清液，获得催化谷胱甘肽生物合成的中 间酶液；

⑤中间酶液超滤浓缩、除杂，获得浓缩酶液；

⑥提取过程①～⑤步骤物料温度维持在0～4℃；

⑦浓缩酶液真空冷冻干燥，获得酶干粉。

10.根据权利要求9所述的生物酶提取方法，其特征在于，所述步骤⑦中采用冻干的方 法获取酶干粉。