[发明专利]乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的快速分子鉴定方法

说明书

本发明公开了一种乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草及其杂交品种的快速鉴定方法，包括如下步骤：1）提取样品DNA；2）用甘草ITS特异性引物扩增样品ITS序列；3）确定ITS序列5’端起第159位和第383‑385位的碱基：如果159位为C，383‑385位为TGC，则鉴定为乌拉尔甘草；如果159位为C和T共存，383‑385位为TGC和CAA共存，则鉴定为杂交品种；如果159位为T，383‑385位为CAA，则进行步骤4）；4）PCR扩增样品的ndhC‑trnV转录间隔区序列；5）确定ndhC‑trnV转录间隔区序列5’端起第487位的碱基：如果487位为A，则鉴定为光果甘草；如果487位碱基为T，则鉴定为胀果甘草。本发明能够对甘草的原植物、药材、种子和种苗等进行准确鉴定，有效解决甘草的品种鉴定、育种栽培以及种质资源开发利用等问题。

技术领域

本发明属于中药材品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点对乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草以及乌拉尔甘草与胀果甘草或光果甘草杂交后产生的样本进行准确鉴定和区分。

背景技术

甘草作为最广泛使用的药用植物之一，在中国、美国、英国、欧洲、日本药典中均有收载。2015版《中国药典》同时收载乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(G. glabra L.)、胀果甘草(G. inflata Bat.)的干燥根和根茎作为甘草药材的来源，我国主产品种为乌拉尔甘草。但不同品种的甘草在不同国家和地区的分布具有差异，例如，在美国和欧洲部分地区，光果甘草是最主要的药用品种。

甘草的传统形态学鉴定方法主要依赖于植物的地上部分特征，难以对甘草药材、饮片以及各种加工品进行品种鉴定。显微鉴定方面，药材横切面的射线形态虽可作为甘草品种区分的依据之一，但存在样品前处理困难、判别标准难以量化等问题，也无法对深加工的药材饮片或粉末进行鉴定。化学成分方面，甘草的成分十分复杂，通过药材指纹图谱分析也较难实现同属植物不同种的准确区分和鉴定。

DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种生物身份识别系统，从而实现对物种的快速准确鉴定。Kenji等曾对不同品种甘草的ITS序列进行扩增和分析比对，发现胀果甘草和光果甘草的ITS序列完全相同，同时与乌拉尔甘草的ITS序列在4个碱基位点存在差异（Biol. Pharm. Bull. 2007, 30, 1497—1502）。因此， ITS序列中的SNP（single nucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性）位点可用于乌拉尔甘草的鉴定。但文献（J. Nat. Prod.,2015, 78, 2007–2022）及本研究团队的实验结果（图1）均表明，在进行甘草样品的ITS序列扩增时，Kenji等所使用的ITS通用引物ITS4/5的扩增成功率和扩增效率较低，因此尚需通过设计甘草ITS专属引物来提高PCR的准确性。此外，胀果甘草和光果甘草尚无较好的分子鉴定方法。Kenji等筛选了叶绿体基因中的4个不同片段，仅trnH-psbA转录间隔区序列仅能对大约80%的胀果甘草和光果甘草进行区分，仍有20%左右的样品无法通过目前已知的SNP位点进行区分和鉴定（Biol. Pharm. Bull. 2007, 30, 1497—1502）。因此，对于三个重要的甘草药用品种，目前尚缺乏准确、高效的分子鉴定方法。

本发明设计了用于甘草ITS序列扩增的特异性引物，继而对甘草中多个叶绿体DNA片段进行了扩增和筛选，最终将甘草ITS序列和ndhC-trnV转录间隔区序列的SNP位点相结合，建立了对乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草三个近缘物种及其杂交品种进行快速品种鉴定的方法，有利于实现甘草的种苗培育、药材和饮片生产的规范化。