[发明专利]使用具有3’发夹结构的水解探针检测单核苷酸多态性

说明书

描述了用于快速检测样品中靶核酸的SNP存在与否的方法。所述方法可包括进行扩增步骤、使用包含偏向3'端的发夹结构的SNP特异性水解探针的杂交步骤以及检测步骤。此外，提供了包含偏向3'端的发夹结构的SNP特异性水解探针连同设计用于检测靶核酸的SNP的试剂盒。

发明领域

本发明涉及基于聚合酶链式反应（PCR）的诊断领域，而更具体地讲，涉及使用水解探针的PCR检测方法。

发明背景

PCR是复制或‘扩增’DNA或RNA小区段的高效率并且成本节约的方式。使用PCR，仅在几小时内就可制造出数以百万计的DNA部分的拷贝，得到分析所需的足够的DNA。此方法使得临床医生可以使用最小量的样品（如血液或组织）来诊断和监测疾病。实时PCR使得扩增和检测可以同时进行。一种检测方法是通过使用寡核苷酸水解探针（也称为TaqMan®探针）完成的，所述探针具有共价连接到例如该寡核苷酸探针5'端的荧光团和例如内部或3'端连接的猝灭剂。 水解探针是双重标记的寡核苷酸探针，其依靠Taq聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性，在与互补靶序列杂交的过程中切割水解探针，并得到基于荧光的检测。

实时PCR方法可被用于在具有单核苷酸多态性（SNP）的靶核酸中扩增和检测序列变异。然而，许多现有的SNP检测/基因分型测定是基于SNP为双等位基因的假设（参见，例如，Morita 等人， Mol.Cel.Probes, 2007, 21, 171-176）。用现有的实时PCR方法检测SNP缺乏足够的灵敏度和特异性。 水解探针（如标准TaqMan®探针）通常被设计成长约18至22个碱基从而具有比引物高8-10℃的解链温度（Tm）。 标准TaqMan®探针一般经证明对于SNP检测的特异性不高并且不太灵敏，而且不能够彻底区分WT（野生型）和MT（突变型）靶标。 现有的基于TaqMan®的SNP基因分型测定涉及使用TaqMan® MGB（小沟结合剂，Minor GrooveBinder）探针，该探针在长度上更短并且对于等位基因的区分具有增加的探针-模板结合稳定性。额外的碱基修饰如稳定碱基（丙炔基dU、丙炔基dC）也可被包括在标准TaqMan®探针设计中用于改进的SNP检测和区分。 因此，在本领域中需要一种以灵敏的方式特异性检测SNP的快速而可靠的方法。

发明概述

本公开的主题包括SNP特异性水解探针，其被设计成包含偏向3'端的发夹结构。此类水解探针并不一定涉及使用额外的碱基修饰（如丙炔基dU、丙炔基dC）或特定分子（如MGB）。靠近探针的3'端的发夹结构会延缓探针的3'部分与模板的杂交，并因而有助于根据报告基因与靠近5'端的猝灭剂之间的单个错配来区分WT和MT靶标。相比WT模板，SNP特异性探针的5'部分可以更有效率地杂交至MT模板。当SNP特异性探针发现WT靶标时，与WT靶标的单个错配可以防止杂交和探针切割，并因而不会检测到荧光。

在一个方面，提供了用于检测样品中靶核酸的SNP的方法，该方法包括：进行扩增步骤，包括使样品与包含第一核酸序列的引物接触，从而当样品中存在任何靶核酸时，产生扩增产物；进行杂交步骤，包括使扩增产物与包含第二核酸序列的SNP特异性水解探针接触，所述第二核酸序列与扩增产物的含有SNP的区域互补，所述SNP特异性水解探针包含第一和第二可相互作用的标记、5'端和3'端以及偏向3'端的发夹结构，所述发夹结构包含含有一个或多个非天然存在的（例如，改变的或额外的）核苷酸的非天然存在的核酸序列区域以产生所述发夹结构；以及检测扩增产物存在与否，其中存在扩增产物表明在靶核酸靶标中存在SNP，而其中不存在扩增产物表明在靶核酸靶标中不存在SNP。在一个实施方案中，第一可相互作用的标记包含处于5'末端的供体荧光部分，并且第二可相互作用的标记包含在水解探针上所述供体荧光部分的不超过5个核苷酸之内的对应的受体荧光部分。在某些实施方案中，受体荧光部分为猝灭剂。在另一个实施方案中，扩增采用具有5'至3'核酸外切酶活性的聚合酶。在另一个实施方案中，引物的第一核酸序列和/或水解探针的第二核酸序列包含至少一个经修饰的核苷酸。在又另一个实施方案中，引物的第一核酸序列和/或水解探针的第二核酸序列具有40个或更少的核苷酸。