[发明专利]分析物富集方法和组合物

说明书

公开了用于富集包含分析物的粒子群体的方法和组合物。在一个实施方案中，使用尺寸大于用于扩增的珠粒的富集珠粒。使用可以保留具有结合的扩增珠粒的较大珠粒的分离装置。该技术具有许多用途，包括富集具有克隆扩增模板的珠粒，其可以用于多种测定法，包括核酸测序。

发明领域

公开了用于富集包含分析物的粒子群体的方法和组合物。在一个实施方案中，使用尺寸大于用于扩增的珠粒的富集珠粒。使用可以保留具有结合的扩增珠粒的较大珠粒的分离装置。该技术具有许多应用，包括富集具有克隆扩增模板的珠粒，其可以用于各种测定法，包括核酸测序。

背景

充分建立了通过聚合酶链反应(PCR)的克隆扩增。分配样品，使得样品内的各核酸分子定位于许多单独的区内。该步骤可以以不同方式进行，包括在微孔、毛细管、室和乳剂中的分离。样品分配能够通过限制稀释控制不同分子的数量。例如，为了确保隔室内两个核酸模板的情况是低频事件，稀释所述模板，使得平均起来每个隔室内少于一个模板分子。作为结果，每个隔室一般包含“0”或“1”个分子；在PCR之后，扩增分别是负的或正的。

克隆扩增的一种方法包括在油乳剂中的水性隔室(即液滴)中以限制模板稀释的固相扩增，其中所述隔室包含粒子(例如珠粒)、模板、核苷酸和核酸扩增。PCR后，一些隔室包含克隆扩增的珠粒，但是仅为10-20％丰度(由泊松分布控制)。这提出了一个效率问题。尽管实现了克隆扩增，但只是存在过多的负反应。如果需要进行另一种反应或分析，则不能对所有珠粒有效地进行，因为仅10-20％含有DNA存在。

所需要的是解决这种效率问题的方法。

发明概述

本发明通过选择性地使具有DNA扩增子的粒子结合富集珠粒(也称作俘获珠粒)并且分离空白珠粒(即缺乏扩增模板的珠粒)解决了低效率问题。优选实施方案之一在于在尺寸上大于用于扩增的珠粒的富集珠粒的应用和可以保留具有结合的扩增珠粒的较大珠粒的分离装置，从而能够使未结合的珠粒流过。在一个实施方案中，富集珠粒被修饰以包含俘获寡核苷酸(也称作俘获探针)或配体/结合配偶体，赋予它们能够仅结合具有DNA扩增子的珠粒(也称作“活”珠粒)。在进行最初的分离后，具有扩增子的离子从富集珠粒中释放。例如，在一个实施方案中，可以使用相同分离装置(例如旋转过滤器)、应用释放溶液释放它们，所述释放溶液打断扩增的珠粒与富集珠粒之间的相互作用。作为结果，携带扩增的DNA的珠粒构成总珠粒群体的80-100％，并且作为用于DNA测序或其它下游分析的更好的样品。并不打算将所述方法或组合物限于核酸方法。该方法和组合物一般适用于任何分析物。

在一个实施方案中，本发明关注富集方法，其包括：a)提供：i)包含一个或多个(且典型地许多)在油中的水性隔室的乳剂，所述隔室的至少一些包含PCR试剂、固定在乳剂珠粒上的第一种引物、溶液中的第二种引物、以及模板；和ii)富集珠粒，其中所述富集珠粒不同于所述隔室中的所述乳剂珠粒；b)使所述乳剂暴露于这样的条件，以便在所述隔室中的至少一些中的所述乳剂珠粒的至少一些上扩增所述模板的至少一些；c)通过使所述乳剂珠粒与所述富集珠粒接触来富集包含扩增模板的乳剂珠粒，其中包含扩增模板的所述乳剂珠粒结合所述富集珠粒，以便构成乳剂珠粒的群体-富集珠粒复合物，且其中不含扩增模板的乳剂珠粒不结合所述富集珠粒；和d)在这样的条件下俘获至少一些所述复合物群体，使得不俘获大部分不含扩增模板的所述乳剂珠粒。本发明还包含，在步骤d)后：e)使复合物的所述群体经历这样的条件，以便使所述包含扩增模板的乳剂珠粒与所述富集珠粒分离，使得大部分所述包含扩增模板的乳剂珠粒与所述富集珠粒分离。