[发明专利]一种用于检测番茄斑萎病毒的NASBA方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病原检测技术领域，具体涉及一种用于检测番茄斑萎病毒的NASBA方法。

背景技术

近年来，番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)以其广泛的寄主范围和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。在20世纪60～80年代，该病毒曾在欧美及非洲的烟草和番茄上大流行，每年的发病率为20％～50％，造成高达数10亿美元的损失。在美国夏威夷、巴西、意大利和南非，TSWV在20世纪80～90年代的流行曾导致番茄、莴苣等作物近乎绝产。近年来，番茄斑萎病毒属病毒特别是TSWV，已成为全世界引起多种经济作物和观赏植物极大经济损失的重要因子。

我国目前种植的辣椒、洋葱、生菜等蔬菜种子很多来自于世界各地，尤其是番茄种子基本依赖进口，进口国别包括美国、日本、荷兰、泰国等国，这些进口国目前都有番茄斑萎病毒的发生与报道，我国口岸曾于2012年在进境的种子中截获TSWV病毒。而传统的TSWV检测及确证方法一般通过生物寄主、形态学试验判定植株是否具有植物病毒，这些方法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要。

目前针对该病毒的检疫鉴定主要局限在电镜技术、血清学技术以及RT-PCR等传统检测技术，如ELISA方法，分子杂交，荧光定量PCR方法，普通PCR方法等等，但在这些方法中，血清学、杂交技术检测灵敏度低，操作步骤繁琐，周期长；电镜、荧光PCR技术依赖大型仪器，因此很多实验室在仪器配置和检测能力上无法达到要求。另外，由于番茄斑萎病毒为单链RNA病毒，易于降解，以上方法操作的复杂性与灵敏度限制了对该病的检测与预报。应用PCR技术检测虽然灵敏，但目前的检测实践表明经常出现检测假阳性或假阴性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测TSWV的NASBA方法，即利用具有高灵敏性和特异性的引物引导，在含有T7RNA聚合酶、RNAseH、反转录酶AMV、NTP、dNTP及反应缓冲液所组成的反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增，对样品中的番茄斑萎病毒进行准确的检测。

本发明首先提供一种用于检测TSWV的NASBA引物，其引物序列分别为SEQ ID NO:1～2。

NA-P1:5′-aattctaatacgactcactatagggagTGTCAGTGGCTCCAATCCTG-3′

NA-P2:5′-aattctaatacgactcactatagggagGCTTTGTTGACACAAGGCAAAG-3′。

本发明还提供一种检测TSWV的试剂盒，包含有如下的组分

1)NASBA扩增反应液A：

每25μL包括10×AMV buffer 2.5μl，6.25mmol/L NTPs 3μL，10mmol/L dNTPs 1.5μL，10μmol/L引物NA-P1、NA-P2各0.5μL，双蒸水9ml；

其中10×AMV buffer为含40mmol/L PH8.5的Tris-HCL，70mmol/L KCL，12mmol/L MgCL₂，5mmol/L DTT的缓冲液；

2)NASBA扩增反应液B:

所述的NASBA扩增反应液B包含有：0.5U RNaseH，32U T7RNA聚合酶，6.4U AMV反转录酶，2μL DMSO，0.1μL1mol/L二硫苏糖醇，0.25μL 10mg/mL BSA，20U RNA酶抑制剂，

上述的试剂盒用于检测TSWV，包含有如下的步骤：

1)样品RNA的提取

A、取0.1g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入1mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃～8℃，12000g，离心10min；

B、取上清，15℃～30℃，放置5min；加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡(勿涡旋振荡)，约15s，15℃～30℃，放置2min～3min；2℃～8℃，12000g，离心15min；

C、吸取600μL的上层水相，加500μL异丙醇混合上清液，15℃～30℃，放置10min；2℃～8℃，12000g，离心10min；

D、去除上清液，沉淀中加入1mL 75％乙醇，洗涤；2℃～8℃，7500g，离心5min；

E、去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30μL～50μL无RNase的水中，即为待检模板RNA；

2)进行TSWV的NASBA扩增