[发明专利]一种用于检测番茄斑萎病毒的NASBA方法

权利要求书

1.一种检测番茄斑萎病毒的NASBA扩增引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物、下游引物的序列分别为SEQ ID NO:1～2。

2.权利要求1所述的引物对在检测植物样品中番茄斑萎病毒的应用。

3.一种检测番茄斑萎病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分：

1)NASBA扩增反应液A：

每25μL包括10×AMV buffer 2.5μl，6.25mmol/L NTPs 3μL，10mmol/L dNTPs 1.5μL，10μmol/L引物NA-P1、NA-P2各0.5μL，双蒸水9ml；其中引物NA-P1、NA-P2为权利要求1所述的上游引物、下游引物；

其中10×AMV buffer为含40mmol/L PH8.5的Tris-HCL，70mmol/L KCL，12mmol/L MgCL₂，5mmol/L DTT的缓冲液；

2)NASBA扩增反应液B:

所述的NASBA扩增反应液B包含有：0.5U RNaseH，32U T7RNA聚合酶，6.4U AMV反转录酶，2μL DMSO，0.1μL1mol/L二硫苏糖醇，0.25μL 10mg/mL BSA，20U RNA酶抑制剂。

4.权利要求3所述的试剂盒在检测植物样品中番茄斑萎病毒的应用。

5.一种使用权利要求3所述的试剂盒检测植物样品中番茄斑萎病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)样品RNA的提取

A、取0.1g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入1mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃～8℃，12000g，离心10min，

B、取上清，15℃～30℃，放置5min；加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡，约15s，15℃～30℃，放置2min～3min；2℃～8℃，12000g，离心15min，

C、小心吸取约为600μL的上层水相，勿扰动中间相和下层相，加500μL异丙醇混合上清液，15℃～30℃，放置10min，2℃～8℃，12000g，离心10min；

D、去除上清液，沉淀中加入1mL 75％乙醇，洗涤；2℃～8℃，7500g，离心5min；

E、去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30μL～50μL无RNase的水中，即为待检模板RNA；

2)进行TSWV的NASBA扩增

A、在装有14μL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3μL待检模板RNA，

B、在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5min，立即转入41℃温浴5min，；

C.在反应管中迅速加入4μL反应液B；

D.于41℃温育2h；

E.将金属浴调到4℃中止反应，3min后取出；

3)电泳检测

取3g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。