[发明专利]全基因组甲基化测序文库及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序文库构建领域，具体而言，涉及一种全基因组甲基化测序文库及其构建方法。

背景技术

DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式。近年来，大量研究表明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生，起着至关重要的作用。甲基化研究成了表观遗传学的热点，相应的技术也是层出不穷，根据实验目的的不同，这些技术大体能够分成两类：全基因组甲基化研究技术以及特异性甲基化位点研究技术。

WGBS(Whole genome bisulfite sequencing)，即全基因组重亚硫酸盐测序。实验原理是：前期用重亚硫酸处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转化成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来；以第二代高通量测序平台为基础，结合全基因组重亚硫酸处理和生物信息数据分析技术，进行低成本、高效率、高准确度的全基因组DNA甲基化水平图谱绘制。

随着二代测序的飞速发展，测序成本大幅度下降，WGBS技术可以绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱，对于研究来讲具有绝对的技术优势。从芯片到第二代高通量测序，从特异性甲基化位点到全基因组甲基化研究，相应的技术也是层出不穷。测序成本大幅度下降使得甲基化组(methylome)的研究成为可能。目前，基于第二代测序平台的基因组甲基化研究，主要包括WGBS、RRBS和MeDIP三种技术，如下表1所示，对于不同的甲基化区域，可以选择不同的技术来实现：

提到甲基化测序，首先想到的必然是“金标准”全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing)，简称BS-seq。该方法的实验原理是前期用Bisulfite处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。WGBS技术可以绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱，对于研究来讲具有绝对的技术优势。

到目前为止，全基因组重亚硫酸盐测序是DNA甲基化研究比较好的方法，但是该方法本身存在设计缺陷，导致生物信息学分析时会降低甲基化程度评估的准确性，阻碍了其应用，因而，仍需要对现有的全基因组甲基化测序方法进行改进，以提高后续甲基化程度评估的准确性。

表1：

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种全基因组甲基化测序文库及其构建方法，以降低现有技术中所构建的文库影响后续全基因组甲基化程度评估的准确性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种全基因组甲基化测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：S1，对全基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，采用由dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP进行末端修复对DNA片段进行末端修复，得到修复片段；S3，对修复片段进行3’末端加“A”，得到3’末端带“A”片段；S4，采用经过“C”到“T”转化处理的接头序列对3’末端带“A”片段进行接头连接，得到带接头的片段；S5，对带接头片段进行“C”到“T”转化处理，得到处理片段；S6，对处理片段进行扩增，得到全基因组甲基化测序文库。

进一步地，在步骤S1之后，以及步骤S2之前，构建方法还包括对DNA片段进行纯化的步骤。

进一步地，纯化的步骤采用DNA亲和柱进行纯化。

进一步地，纯化的步骤采用QIAquick PCR纯化试剂盒对DNA片段进行纯化。

进一步地，在步骤S2中，采用End-It试剂盒中的dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对DNA进行末端修复，得到修复片段。

进一步地，在步骤S2之后，以及步骤S3之前，构建方法还包括对修复片段进行纯化的步骤。

进一步地，在步骤S3之后，以及步骤S4之前，还包括采用Ampure XP磁珠对3’末端带“A”片段进行纯化的步骤。

进一步地，在步骤S4之后，以及步骤S5之前，构建方法还包括对带接头片段进行定量的步骤。

进一步地，在步骤S5中，采用EZ DNA Methylation-Lightning^TM试剂盒对带接头片段进行“C”到“T”转化处理，得到处理片段。

根据本发明的另一方面，提供了一种全基因组甲基化测序文库，采用上述任一种构建方法构建而成。