[发明专利]一种甲基化DNA的测序方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种甲基化DNA的测序方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化是表观遗传调控中的重要修饰之一，被称之为哺乳动物DNA中除ATCG四种碱基以外的“第五种碱基”。在哺乳动物胚胎干细胞和大脑中它主要发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶苯环第五位碳原子上，少部分发生在CHG和CHH(H＝A,T,C)上。作为一种共价修饰，DNA甲基化在正常的分化发育和疾病发生中发挥重要作用，同时在更高等真核生物器官的细胞分化中可以稳定遗传，并且在斑马鱼中发现它可以通过精子传给下一代。在细胞分化、疾病和环境影响下，DAN甲基化状态会发生巨大变化。因此，5mC位点的检测以及DNA甲基化水平的评估对发育和疾病发生中DNA甲基化状态的揭示显得尤为重要。

由于2007年高通量测序技术的进步，一些基因组DNA甲基化检测技术也得到发展。在单分子水平定量检测5mC方面，甲基化测序无疑是最强大和全面的一种方法。然而，甲基化测序需要测到至少整个基因组30倍的测序深度，并且对于大样本大基因组的DNA甲基化组的测定，是极其昂贵的。简化的代表性的重亚硫酸盐测序(RRBS)实现单碱基分辨率方案，但是只描绘了覆盖整个基因组的5％并且局限于CpG岛(CGIs)的甲基化图谱。然而，不同样本间的甲基化组分析表明大部分组织和癌症特定的差异甲基化区域发生在CpG岛附近。甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)实现了高达67％的CpG的覆盖度，而RRBS只覆盖了最少的基因组水平的CpGs(12％)。但是，MeDIP-seq不能实现单碱基分辨率，同时也不能检测非CpG的甲基化状。

发明内容

为了克服MeDIP-seq和MethylC-seq的缺陷但又综合两者的优势，我们将亚硫酸盐处理整合到MeDIP-seq的方法中，组成定义为甲基化DNA免疫沉淀亚硫酸盐测序(MB-seq)。

由于在MeDIP方法中连接了甲基化接头的未甲基化的片段会被非特异的拉下，另外未甲基化的Illumina测序接头中的胞嘧啶在亚硫酸盐处理后也会被转化为尿嘧啶，这将导致接头连接的DNA片段不能匹配Illumina测序，因此在MB-seq中这些接头是不适用的。基于羟甲基化的DNA片段不能被5mC抗体富集并且在亚硫酸处理过程中羟甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶有同样的效果，我们创造性地将羟甲基化的接头(接头中所有的胞嘧啶都是羟甲基化的)引入MB-seq中。

具体而言，本发明提供了下述内容：

一种甲基化DNA的测序方法，包括建库步骤和测序步骤：

其中建库步骤是指获得待检测的甲基化DNA文库的步骤，所述建库步骤包括：

1)基因组DNA的片段化及双链DNA片段末端修复；

2)将1)中得到的DNA片段与羟甲基化修饰的寡核苷酸接头连接；

3)富集步骤2)中的甲基化DNA片段；

4)将步骤3)中得到的产物中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基；

5)将4)中的单链DNA通过引物进行扩增以获得双链DNA；

6)去除接头回收纯化DNA。

其中测序步骤是指对前述建库步骤获得的文库进行序列测定，还包括如下步骤：

7)对步骤6)中获得的双链DNA进行测序。

其中建库步骤和测序步骤中，步骤1)包括：

a)将基因组DNA片段化成为DNA片段；

b)将所述DNA片段进行末端修复以获得具有平末端的DNA片段；

c)将2)中得到的DNA片段的3’末端加上A碱基；

本发明中，所述羟甲基化修饰的寡核苷酸接头中所有的碱基胞嘧啶都是羟甲基化的。

本发明中，步骤3)中的富集羟甲基化DNA通过MeDIP技术进行的。

本发明中，步骤4)中通过亚硫酸盐处理试剂盒将DNA中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基。

本发明中，步骤5)中通过高保真DNA聚合酶将单链DNA进行扩增以获得双链DNA。

本发明中，步骤6)中用胶回收试剂盒通过凝胶电泳回收纯化的DNA。

本发明还提供了所述方法构建得到的DNA测序文库。

本发明中还提供了一种试剂盒，其中至少包含用于DNA末端修复的试剂，DNA 3’端加A的试剂，羟甲基化修饰的接头试剂、通过MeDIP技术富集甲基化DNA的试剂，用于将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的亚硫酸氢盐试剂，用于扩增的试剂，用于胶回收的试剂。其中，所述扩增的试剂包括引物。