[发明专利]自动化酵母出芽测量

说明书

优先要求权和相关专利申请

本申请要求2012年10月18日提交的美国临时申请系列No.61/715,496的优先权利益，所述临时申请的全部内容作为整体通过参考并入本文。

技术领域

本发明总的来说涉及酵母细胞的分析和测量。更具体来说，本发明涉及用于评估和测量酵母细胞的酵母出芽、活性(viability)和浓度的高效且有效的方法和组合物。

背景技术

生物燃料和酿造工业一直利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为主要生物体来开始生产CO₂和生物乙醇作为产物的发酵过程。目前，最大的生物燃料过程严重依赖于乙醇生产，其利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对甘蔗、玉米粉、多糖和废水进行发酵。由于它们的高的乙醇耐受性、最终乙醇浓度、葡萄糖转化率和工业发酵在历史上的稳健性(historical robustness)，酵母是用于生物乙醇生产的理想组分。(Antoni等，2007Appl.Microbiol.Biotech.vol.77,pp.23-35；Vertès等，2008J.Mol.Microbiol.and Biotech.vol.15,pp.16-30；Basso等，2008FEMS Yeast Res.vol.8,pp.1155-1163；等，2009J.Chem.Technolog.Biotech.vol.84,pp.497-503；Gibbons等，2009In Vitro Cell.&Developm.Biol.-Plant,vol.45,pp.218-228；Hu等，2007Genetics,vol.175,pp.1479-1487；Argueso等，2009Genome Res.vol.19,pp.2258-2270；Eksteen等，2003Biotech.and Bioeng.vol.84,pp.639-646。)

酵母出芽是酿酒厂和生物燃料公司用于确定发酵质量的最重要的参数之一。用于繁殖和发酵的酵母接种时间(pitching time)是样品中出芽酵母的百分率，已知其能够估算酵母的生长率。目前，没有现有的简单的自动酵母出芽检测方法。成像流式细胞仪已被用于进行酵母细胞周期测定以测量出芽百分率。(Meredith等，2008Cytometry Part A,73A:825-833。)然而，成像流式细胞仪相对昂贵并且需要相当大量的维护以及训练有素的技术人员进行操作。因此，它不适合于工业生产背景中的质量保证。此外，由于样品中大的玉米糖化醪残渣会堵塞系统中的流体通路，因此基于流动的样品制备不能用于生物燃料样品。

用于浓度、活性和酵母出芽百分率的常规分析方法包括在常规光学显微镜下在血细胞计数器中对酵母颗粒进行手动计数和在铺板中对菌落形成单位进行菌落计数。这些方法是繁琐和耗时的，并且由于操作人员的主观性而固有地不一致。为了获得在发酵期间酵母行为的准确体现，需要用于测量样品的浓度、活性和出芽百分率的自动方法。

因此，对用于准确且高效测量酵母的浓度、活性和出芽百分率的自动方法，存在着未满足的需求。

发明概述

本发明部分是基于用于自动测量酵母出芽百分率的高效和有效方法的发现。本发明克服了以前方法的缺点，通过本发明的方法可以容易地并准确地分析例如来自于生物燃料和葡萄酒生产厂的实时样品。由于本发明允许高的染色特异性，因此可以有效地测量混杂的样品。由于允许快速、准确和同时测定酵母出芽、浓度和活性，本发明的自动的、基于图像的细胞计量方法极大简化了生物燃料和酿造工业的测量过程。

一方面，本发明总的来说涉及一种用于自动分析酵母细胞的出芽状态的方法。所述方法包括：在缓冲溶液中用染料对将要进行酵母细胞出芽分析的样品进行染色；获取所述染料染色的样品的荧光图像；通过基于计算机的自动化处理分析所述染料染色的样品的所述荧光图像，以确定所述染料染色的样品中酵母细胞的图像的纵横比，由此确定所述样品中出芽的酵母细胞的状态。