[发明专利]一种疫苗组合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品，特别是涉及一种疫苗组合物，以及制备方法和应用。

背景技术

兔瘟是对养兔业造成危害最大的一种病毒性传染病，具有高度接触致死性，其病原体是兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）。RHDV经呼吸道和消化道的黏膜进行感染，主要感染3月龄以上的家兔，发病率为90%-100%，致死率为95%-100%。

RHDV为杯状病毒科（Caliciviridae）、兔病毒属（Lagovirus），为单股正链RNA病毒，其基因组长7437nt，含有2个开放阅读框（ORF），无囊膜，表面有壳粒。RHDV病毒粒子的衣壳由180个亚单位组成，这些亚单位在化学结构上完全相同，单体分子称为VP60。VP60是RHDV的主要结构蛋白，分子量约为60kDa，可刺激机体产生中和抗体。

目前，疫苗免疫对RHDV的预防和/或治疗起重要作用。然而市场上销售的兔瘟疫苗大多为组织灭活苗，需通过注射免疫，且免疫后易出现结块等副作用。另外，RHDV组织灭活疫苗在制备时，需将兔瘟病毒注射兔，取致死兔肝、脾组织进行灭活，从而导致出现病毒逃逸的生物安全问题。

陈宝林等公开了一种兔瘟疫苗（新剂型兔瘟疫苗的研究[J]中国畜禽传染病19971：28-30），将攻毒后兔肝脏等器官经研磨后加入福尔马林灭活加入油乳剂制成疫苗。然而该兔瘟油乳剂灭活苗吸收差，有大小不一颗粒及针头状出血点，免疫后25天尚未完全吸收。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种疫苗组合物，该疫苗组合物采用鼠伤寒沙门氏菌载体表达兔瘟病毒VP60蛋白，以制备RHDVVP60蛋白重组活载体疫苗，从而解决了现有的兔瘟组织灭活疫苗需通过注射免疫，及其免疫后所造成的易出现结块等副作用的问题；还解决了现有的兔瘟组织灭活疫苗制备过程中，存在病毒逃逸的生物安全问题。

本发明的兔瘟疫苗组合物可通过口服途径进行免疫，解决了现有兔瘟病毒疫苗需注射免疫，以及免疫后注射部位出现结块等问题；制备过程也比较安全，同时避免了病毒逃逸的生物安全问题。

本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的含有兔瘟病毒VP60蛋白核酸序列的表达载体的沙门氏菌。

优选地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的蛋白序列为SEQ ID NO.2；更优选地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

优选地，所述表达载体为原核表达载体；更优选地，所述载体携带asd基因，可编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；进一步优选地，所述载体为pYA3341、pYA3342、pYA248、pYA262中的一种或几种或其改进型。

优选地，所述沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌；更优选地，所述沙门氏菌为asd基因缺陷型菌株；进一步优选，所述沙门氏菌为asd基因缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550。

优选地，所述疫苗组合物进一步包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为脱脂奶粉、蔗糖、明胶、海藻糖中的一种或几种。

优选地，所述疫苗组合物中沙门氏菌含量为≥1×10⁹cfu/头份；优选地，所述沙门氏菌含量为≥1×10¹⁰cfu/头份。

本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物的制备方法，所述方法包括：（1）反转录兔瘟病毒VP60基因，将其连接到克隆载体扩增，然后连接到表达载体，获得重组表达质粒；（2）将所述重组表达质粒转入第一中间宿主菌扩增，然后转入第二中间宿主菌进行甲基化修饰，获得经甲基化修饰的重组质粒；（3）将所述重组质粒转入终宿主菌，诱导表达，获得兔瘟疫苗组合物。

优选地，所述步骤（1）中克隆载体为pGEM-T、pMD18-T、pMD19-T、PUC18的一种或几种；所述的表达载体为携带asd基因、可编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的原核表达载体。

优选地，所述步骤（2）中所述的第一中间宿主菌为X6212，所述的第二中间宿主菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730；所述步骤（3）中所述的终宿主菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，更优选为所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550为asd基因缺陷型菌株。

本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗兔瘟病毒性传染病的药物中的应用。

基于此，本发明具有以下突出的优点：