[发明专利]一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组酶。具体是应用微生物工程菌生产水解淀粉为果葡糖浆的酶系。

背景技术

果葡糖浆是一种新型甜味剂。果葡糖浆的甜度最高，相当于蔗糖1.8倍，并且果葡糖浆具有类似蜜糖的风味和不易引起血糖升高的性能。当前，国内外需求量大，主要应用于食品领域的饮料、面包、奶制品、罐头、果糖和其它食品。淀粉是制备果葡糖浆的主要是原料。

用不甜的淀粉为原料转变成具有甜味的葡萄糖，再通过异构化反应转变葡萄糖生成果糖，生产果葡糖浆(果糖和葡萄糖的混合物)。

淀粉由直链和支链组成。支链由α-1，6糖苷键连接，而直链的糖分子之间由α-1，4糖苷键连接。在天然的淀粉质原料中，支链淀粉的含量约占70％～95％，而直链淀粉的含量≤30％。异淀粉酶(Isoamylase，E.C.3.2.1.68)能专一性地分解支链淀粉中分支点的α-1，6糖苷键，将支链淀粉转化为直链淀粉，因此又称为脱支酶。葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，E.C.3.2.1.3)，简称糖化酶。葡萄糖淀粉酶能催化直链淀粉水解为葡萄糖。在异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的联合作用下，淀粉水解生成葡萄糖。木糖异构酶具有异构葡萄糖为果糖的功能。酶法生产果葡糖浆是果葡糖浆生产的主要途径。当前，酶法生产果葡糖浆的方法是先生产异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，通过异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用，将淀粉水解生成葡萄糖；然后，再用木糖异构酶异构葡萄糖为果糖，生产果糖与葡萄糖混合的果葡糖浆。这些酶的分别生产需要大量的人力和能耗。

当前市面上只有这些酶的单种酶，尚没有混合表达这些酶的菌种和混合酶产品。毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。

发明内容

本发明根据异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶具有联合水解淀粉生成果葡糖浆的作用(即异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶是水解淀粉生成果葡糖浆的酶系)，市场上还没有异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的水解淀粉生成果葡糖浆的酶系产品；毕赤酵母、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌是常用于表达外源蛋白的宿主菌，而通过分子生物学技术构建含异淀粉酶基因表达框架(说明.表达框架：启动子-信号肽-基因-转录终止子)、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。用含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产水解淀粉为果葡糖浆的酶系(异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶)。

本发明所采用的技术方案是：

1.克隆酶基因：应用分子生物学技术，从假单胞杆菌(pseudomonas)基因组中扩增异淀粉酶基因，从曲霉(Aspergillus)基因组中扩增葡萄糖淀粉酶基因，从栖热菌(Thermus)基因组中扩增木糖异构酶基因。

2.获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因。

3.构建如附图1的毕赤酵母表达载体、附图2的酿酒酵母表达载体和附图3的枯草芽孢杆菌表达载体。

4.应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母；应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母；应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。分别筛选高表达异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的毕赤酵母重组子、酿酒酵母重组子和枯草芽孢杆菌重组子作为含异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。

5.分别发酵含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系(异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶)。