[发明专利]用于生产L-2-氨基丁酸的载体、工程菌株及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及用于生产L-2-氨基丁酸的载体、工程菌株及方法。

背景技术

L-2-氨基丁酸(L(+)-2-Aminobutyric acid)，是一种非天然的手性α-氨基酸，分子式为C₄H₉NO₂，主要用于合成治疗局限性及继发性全身性癫痫的疾病，同时也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇的关键手性前体。

转氨酶法是目前广泛应用的生产L-2-氨基丁酸的方法。早期采用酮酸和谷氨酸为底物，在氨基酸转氨酶的作用下生成L-2-氨基丁酸，该法收率较低；后采用L-苏氨酸为原料，采用三酶体系制备L-2-氨基丁酸，该法产率低且有副产物影响产品的纯化；氨基酸氧化酶法是使用D-氨基酸氧化酶在金属催化剂的作用下制备L-2-氨基丁酸，该法成本高，不适合大规模工业应用。

此外还有脱氢酶法、氨基酰化酶法等，但是存在生产成本过高以及酶活受到底物抑制的问题，因此工业应用效果不佳。因此本领域迫切需要开发高效经济的L-2-氨基丁酸的生产方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于构建发酵生产L-2-氨基丁酸的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种用于发酵生产L-2-氨基丁酸的基因工程菌株。

本发明的另一目的在于提供一种生产L-2-氨基丁酸的方法。

本发明另一目的在于提供前述载体、工程菌株和生产方法的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种重组载体，所述重组载体具有编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列和编码L-氨基酸脱氢酶的多核苷酸序列。

在另一优选例中，编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列选自下组：

大肠杆菌来源的ilvA基因、大肠杆菌来源的TdcB基因、芽孢杆菌来源的ilvAbs基因、鼠伤寒沙门氏菌来源的苏氨酸脱氨酶基因、或拟南芥来源的苏氨酸脱氨酶基因。

在另一优选例中，编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列为：大肠杆菌来源的ilvA基因或大肠杆菌来源的TdcB基因。

在另一优选例中，所述的L-氨基酸脱氢酶选自下组：L-亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-缬氨酸脱氢酶、L-苯丙氨酸脱氢酶。

在另一优选例中，编码L-氨基酸脱氢酶的多核苷酸序列选自下组：

芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶编码基因、古球菌来源的L-丙氨酸脱氢酶编码基因、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶编码基因、嗜热放线菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶编码基因，或芽孢杆菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶编码基因。

在另一优选例中，编码L-氨基酸脱氢酶的多核苷酸序列为：

芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因，嗜热芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因，或链霉菌来源的缬氨酸脱氢酶基因。

在另一优选例中，所述的重组载体从5’端到3’端依次具有：第一启动子、苏氨酸脱氨酶编码序列和第一终止子、L-氨基酸脱氢酶编码序列和第二终止子。

在另一优选例中，所述的重组载体从5’端到3’端依次具有：第一启动子、苏氨酸脱氨酶ilvA编码序列和第一终止子、L-亮氨酸脱氢酶基因leuDH编码序列和第二终止子。

在另一优选例中，苏氨酸脱氨酶ilvA编码序列来源于大肠杆菌W3110。

在另一优选例中，L-亮氨酸脱氢酶基因leuDH编码序列来源于芽孢杆菌Bacillus cereus。

在另一优选例中，所述的重组载体为pSUGAP-ilvA-leuDH，pSUGAP-leuDH-ilvA，pSUGAP-ilvA-BSleuDH，pSUGAP-Vdh-ilvA，pSUGAP-TdcB-leuDH，pSUGAP-TdcB-BSleuDH，或pSUGAP-Vdh-tdcB。

在本发明的第二方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第一方面所述的载体或基因组中整合有本发明第一方面任一所述的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，较佳地为大肠杆菌细胞。

在另一优选例中，所述的大肠杆菌是高表达苏氨酸的大肠杆菌。

在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有选自下组的至少一个特征：

(1)天冬氨酸激酶I基因thrA的1034位碱基发生C→T突变；

(2)天冬氨酸激酶III基因lysC的1055位碱基发生C→T突变；

(3)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc启动子为trc启动子；